تكشف البروتينات الشاملة عن المؤشرات الحيوية للسائل النخاعي المستندة إلى الدماغ في مرض الزهايمر بدون أعراض وأعراض

يفتقر مرض الزهايمر (AD) إلى المؤشرات الحيوية البروتينية التي تعكس الفيزيولوجيا المرضية المتعددة الأساسية، مما يعيق تقدم التشخيص والعلاج. هنا، نحن نستخدم البروتينات الشاملة لتحديد المؤشرات الحيوية للسائل النخاعي (CSF) التي تمثل مجموعة واسعة من الفيزيولوجيا المرضية لمرض الزهايمر. حدد قياس الطيف الكتلي المتعدد ما يقرب من 3500 وحوالي 12000 بروتين في AD CSF والدماغ، على التوالي. أدى تحليل شبكة بروتين الدماغ إلى حل 44 وحدة للتنوع البيولوجي، 15 منها تتداخل مع بروتين السائل النخاعي. يتم طي علامات CSF AD في هذه الوحدات المتداخلة في خمس مجموعات بروتينية، تمثل عمليات فيزيولوجية مرضية مختلفة. تنخفض المشابك العصبية والمستقلبات في دماغ AD، ولكن يزداد السائل الدماغي الشوكي، في حين تزداد الميالين الغني بالدبقية والمجموعات المناعية في الدماغ والسائل الدماغي الشوكي. تم تأكيد اتساق وخصوصية تغييرات اللوحة في أكثر من 500 عينة إضافية من السائل الدماغي الشوكي. حددت هذه المجموعات أيضًا مجموعات فرعية بيولوجية في مرض الزهايمر بدون أعراض. بشكل عام، تعد هذه النتائج خطوة واعدة نحو أدوات العلامات الحيوية المستندة إلى الويب للتطبيقات السريرية في مرض الزهايمر.
مرض الزهايمر (AD) هو السبب الأكثر شيوعًا للخرف التنكس العصبي في جميع أنحاء العالم ويتميز بمجموعة واسعة من اختلالات النظام البيولوجي، بما في ذلك النقل المتشابك، والمناعة الدبقية، واستقلاب الميتوكوندريا (1-3). ومع ذلك، لا تزال المؤشرات الحيوية للبروتين تركز على اكتشاف بروتين الأميلويد والتاو، وبالتالي لا يمكنها أن تعكس هذه الفيزيولوجيا المرضية المتنوعة. تشمل هذه المؤشرات الحيوية للبروتين "الأساسي" والتي يتم قياسها بشكل أكثر موثوقية في السائل النخاعي (CSF) (1) ببتيد بيتا الأميلويد 1-42 (Aβ1-42)، والذي يعكس تكوين لويحات الأميلويد القشرية؛ (ثانيا) مجموع تاو، علامة على انحطاط محور عصبي؛ (ثالثا) فوسفو تاو (ف تاو)، ممثل فرط الفسفرة تاو المرضية (4-7). على الرغم من أن هذه المؤشرات الحيوية للسائل النخاعي قد سهلت إلى حد كبير اكتشافنا لأمراض البروتين AD "المميزة" (4-7)، إلا أنها لا تمثل سوى جزء صغير من البيولوجيا المعقدة وراء المرض.
أدى الافتقار إلى التنوع الفيزيولوجي المرضي للمؤشرات الحيوية لمرض الزهايمر إلى العديد من التحديات، بما في ذلك (1) عدم القدرة على تحديد وقياس عدم التجانس البيولوجي لمرضى مرض الزهايمر، (2) عدم كفاية قياس شدة المرض وتطوره، خاصة في المرحلة قبل السريرية، و ( 3) تطوير الأدوية العلاجية التي فشلت في حل جميع جوانب التدهور العصبي بشكل كامل. إن اعتمادنا على علم الأمراض التاريخي لوصف مرض الزهايمر من الأمراض ذات الصلة لا يؤدي إلا إلى تفاقم هذه المشاكل. تظهر المزيد والمزيد من الأدلة أن معظم كبار السن المصابين بالخرف لديهم أكثر من سمة مرضية للتدهور المعرفي (8). ما يصل إلى 90٪ أو أكثر من الأفراد المصابين بمرض الزهايمر يعانون أيضًا من أمراض الأوعية الدموية، أو شوائب TDP-43، أو أمراض تنكسية أخرى (9). وقد أدت هذه النسب العالية من التداخل المرضي إلى تعطيل إطارنا التشخيصي الحالي للخرف، وهناك حاجة إلى تعريف فيزيولوجي مرضي أكثر شمولاً للمرض.
في ضوء الحاجة الملحة لمجموعة متنوعة من المؤشرات الحيوية لمرض الزهايمر، يتبنى هذا المجال بشكل متزايد طريقة "omics" القائمة على النظام الشامل لاكتشاف المؤشرات الحيوية. تم إطلاق الشراكة الصيدلانية المتسارعة (AMP)-AD Alliance في عام 2014 وهي في طليعة البرنامج. يهدف هذا الجهد متعدد التخصصات الذي تبذله المعاهد الوطنية للصحة والأوساط الأكاديمية والصناعة إلى استخدام الاستراتيجيات القائمة على النظام لتحديد الفيزيولوجيا المرضية لمرض الزهايمر بشكل أفضل وتطوير التحليل التشخيصي للتنوع البيولوجي واستراتيجيات العلاج (10). وكجزء من هذا المشروع، أصبحت بروتينات الشبكة أداة واعدة لتطوير المؤشرات الحيوية القائمة على النظام في مرض الزهايمر. ينظم هذا النهج غير المتحيز القائم على البيانات مجموعات بيانات البروتينات المعقدة في مجموعات أو "وحدات" من البروتينات المعبر عنها بشكل مشترك والتي ترتبط بأنواع خلايا وعضيات ووظائف بيولوجية محددة (11-13). تم إجراء ما يقرب من 12 دراسة بروتينية شبكية غنية بالمعلومات على الدماغ AD (13-23). بشكل عام، تشير هذه التحليلات إلى أن بروتين شبكة الدماغ AD يحافظ على تنظيم معياري محفوظ للغاية في مجموعات مستقلة ومناطق قشرية متعددة. بالإضافة إلى ذلك، تظهر بعض هذه الوحدات تغييرات قابلة للتكرار في الوفرة المرتبطة بمرض الزهايمر عبر مجموعات البيانات، مما يعكس الفيزيولوجيا المرضية لأمراض متعددة. بشكل جماعي، تُظهر هذه النتائج نقطة ربط واعدة لاكتشاف بروتين شبكة الدماغ كمؤشر حيوي قائم على النظام في مرض الزهايمر.
من أجل تحويل بروتين شبكة الدماغ AD إلى مؤشرات حيوية قائمة على النظام مفيدة سريريًا، قمنا بدمج الشبكة المشتقة من الدماغ مع التحليل البروتيني لـ AD CSF. أدى هذا النهج المتكامل إلى تحديد خمس مجموعات واعدة من المؤشرات الحيوية للسائل الدماغي الشوكي المرتبطة بمجموعة واسعة من الفيزيولوجيا المرضية المستندة إلى الدماغ، بما في ذلك المشابك العصبية، والأوعية الدموية، والميالين، والالتهاب، وخلل المسارات الأيضية. لقد نجحنا في التحقق من صحة لوحات العلامات الحيوية هذه من خلال تحليلات النسخ المتماثل المتعددة، بما في ذلك أكثر من 500 عينة من السائل الدماغي الشوكي من أمراض التنكس العصبي المختلفة. تتضمن تحليلات التحقق هذه فحص أهداف المجموعة في السائل الدماغي الشوكي للمرضى الذين يعانون من مرض الزهايمر بدون أعراض (AsymAD) أو إظهار دليل على تراكم الأميلويد غير الطبيعي في بيئة معرفية طبيعية. تسلط هذه التحليلات الضوء على عدم التجانس البيولوجي الكبير بين سكان AsymAD وتحدد علامات اللوحة التي قد تكون قادرة على تصنيف الأفراد في المراحل الأولى من المرض. بشكل عام، تمثل هذه النتائج خطوة أساسية في تطوير أدوات العلامات الحيوية للبروتين بناءً على أنظمة متعددة يمكنها حل العديد من التحديات السريرية التي يواجهها مرض الزهايمر بنجاح.
الغرض الرئيسي من هذه الدراسة هو تحديد المؤشرات الحيوية الجديدة للسائل النخاعي التي تعكس الفيزيولوجيا المرضية المختلفة القائمة على الدماغ والتي تؤدي إلى مرض الزهايمر. يوضح الشكل S1 منهجية البحث الخاصة بنا، والتي تتضمن (1) تحليلًا شاملاً مدفوعًا بالنتائج الأولية لـ AD CSF وبروتينات الدماغ الشبكية لتحديد المؤشرات الحيوية المتعددة لمرض CSF المرتبطة بالدماغ، و(2) التكرار اللاحق لهذه المؤشرات الحيوية في العديد من المؤشرات الحيوية النخاعية المستقلة. مجموعات السوائل. بدأ البحث الموجه نحو الاكتشاف بتحليل التعبير التفاضلي لـ CSF في 20 فردًا طبيعيًا معرفيًا و20 مريضًا مصابًا بمرض الزهايمر في مركز أبحاث مرض الزهايمر إيموري جويزويتا (ADRC). يتم تعريف تشخيص مرض الزهايمر على أنه ضعف إدراكي كبير في وجود انخفاض Aβ1-42 ومستويات مرتفعة من إجمالي تاو وp-tau في السائل النخاعي [متوسط ​​التقييم المعرفي لمونتريال (MoCA)، 13.8 ± 7.0] [ELISA (ELISA) )]] (الجدول S1A). كان للتحكم (يعني MoCA، 26.7 ± 2.2) مستويات طبيعية من المؤشرات الحيوية لـ CSF.
يتميز السائل الدماغي الشوكي البشري بنطاق ديناميكي من وفرة البروتين، حيث يمكن للألبومين والبروتينات الأخرى الوفيرة للغاية أن تمنع اكتشاف البروتينات محل الاهتمام (24). لزيادة عمق اكتشاف البروتين، قمنا بإزالة أول 14 بروتينًا وفيرة للغاية من كل عينة من عينات CSF قبل تحليل قياس الطيف الكتلي (MS) (24). تم تحديد ما مجموعه 39805 ببتيدًا بواسطة مرض التصلب العصبي المتعدد، والتي تم تعيينها إلى 3691 بروتينًا في 40 عينة. يتم إجراء تقدير كمية البروتين عن طريق وضع علامات الكتلة الترادفية المتعددة (TMT) (18، 25). من أجل حل البيانات المفقودة، قمنا فقط بتضمين تلك البروتينات التي تم قياسها كمياً في 50% على الأقل من العينات في التحليل اللاحق، وبالتالي تحديد 2875 بروتيناً في النهاية. نظرًا للاختلاف الكبير في إجمالي مستويات وفرة البروتين، تم اعتبار عينة التحكم إحصائيًا نموذجًا شاذًا (13) ولم يتم تضمينها في التحليل اللاحق. وتم تعديل قيم الوفرة للعينات الـ 39 المتبقية حسب العمر والجنس والتباين المشترك (13-15، 17، 18، 20، 26).
باستخدام تحليل اختبار t الإحصائي لتقييم التعبير التفاضلي في مجموعة بيانات الانحدار، حدد هذا التحليل البروتينات التي تغيرت مستويات وفرتها بشكل كبير (P <0.05) بين حالات التحكم وحالات AD (الجدول S2A). كما هو مبين في الشكل 1A، تم تقليل وفرة ما مجموعه 225 بروتينًا في م بشكل ملحوظ، وزادت وفرة 303 بروتينات بشكل ملحوظ. تتضمن هذه البروتينات المعبر عنها تفاضليًا العديد من علامات AD للسائل النخاعي التي تم تحديدها مسبقًا، مثل بروتين تاو المرتبط بالأنيبيبات الدقيقة (MAPT؛ P = 3.52 × 10−8)، والخيط العصبي (NEFL؛ P = 6.56 × 10−3)، والبروتين المرتبط بالنمو 43. (GAP43؛ P = 1.46 × 10−5)، بروتين ربط الأحماض الدهنية 3 (FABP3؛ P = 2.00 × 10−5)، الكيتيناز 3 مثل 1 (CHI3L1؛ P = 4.44 × 10−6)، الجرانولين العصبي (NRGN؛ P = 3.43 × 10−4) وعامل نمو العصب VGF (VGF؛ P = 4.83 × 10−3) (4-6). ومع ذلك ، فقد حددنا أيضًا أهدافًا أخرى مهمة جدًا ، مثل مثبط تفكك الناتج المحلي الإجمالي 1 (GDI1 ؛ P = 1.54 × 10-10) وربط الكالسيوم المعياري المرتبط بـ SPARC 1 (SMOC1 ؛ P = 6.93 × 10-9). كشف تحليل الجينات (GO) لـ 225 من البروتينات المخفضة بشكل كبير عن وجود روابط وثيقة مع عمليات سوائل الجسم مثل استقلاب الستيرويد، وتخثر الدم، والنشاط الهرموني (الشكل 1B والجدول S2B). في المقابل، فإن زيادة البروتين 303 بشكل ملحوظ ترتبط ارتباطًا وثيقًا ببنية الخلية واستقلاب الطاقة.
(أ) تُظهر مؤامرة البركان تغيير أضعاف log2 (المحور السيني) بالنسبة إلى القيمة الإحصائية P -log10 (المحور الصادي) التي تم الحصول عليها بواسطة اختبار t، والذي يستخدم للكشف عن التعبير التفاضلي بين عنصر التحكم (CT) و حالات إعلان بروتين CSF من جميع البروتينات. تظهر البروتينات ذات المستويات المنخفضة بشكل ملحوظ (P <0.05) في مرض الزهايمر باللون الأزرق، بينما تظهر البروتينات ذات المستويات المرتفعة بشكل ملحوظ في المرض باللون الأحمر. يتم تسمية البروتين المحدد. (ب) يتم تقليل أهم مصطلحات GO المتعلقة بالبروتين بشكل كبير (الأزرق) وزيادة (الأحمر) في م. يُظهر مصطلحات GO الثلاثة ذات أعلى درجات z في مجالات العمليات البيولوجية والوظائف الجزيئية والمكونات الخلوية. (C) قام MS بقياس مستوى MAPT في عينة CSF (يسار) وارتباطه بمستوى عينة ELISA tau (يمين). يتم عرض معامل ارتباط بيرسون مع قيمة P ذات الصلة. ونظرًا لعدم وجود بيانات ELISA لحالة واحدة من حالات AD، فإن هذه الأرقام تتضمن قيمًا لـ 38 حالة من أصل 39 حالة تم تحليلها. (D) التحليل العنقودي الخاضع للإشراف (P <0.0001، قام Benjamini-Hochberg (BH) بتعديل P <0.01) على عنصر التحكم ووجد AD CSF عينات باستخدام البروتينات الـ 65 الأكثر تغيرًا بشكل ملحوظ في مجموعة البيانات. توحيد، تطبيع.
يرتبط المستوى البروتيني لـ MAPT ارتباطًا وثيقًا بمستوى ELISA tau المقاس بشكل مستقل (r = 0.78، P = 7.8 × 10-9؛ الشكل 1C)، مما يدعم صحة قياس MS الخاص بنا. بعد هضم التربسين على مستوى بروتين السلائف الأميلويد (APP)، لا يمكن تأين الببتيدات الخاصة بالإيزوفورم المعينة للطرف C لـ Aβ1-40 وAβ1-42 بكفاءة (27، 28). لذلك، فإن ببتيدات APP التي حددناها لا علاقة لها بمستويات ELISA Aβ1-42. من أجل تقييم التعبير التفاضلي لكل حالة، استخدمنا البروتينات المعبر عنها تفاضليًا مع P <0.0001 [تصحيح معدل الاكتشاف الخاطئ (FDR) P <0.01] لإجراء تحليل عنقودي خاضع للإشراف للعينات (الجدول S2A). كما هو مبين في الشكل 1د، يمكن لهذه البروتينات البالغة الأهمية البالغ عددها 65 بروتينًا تجميع العينات بشكل صحيح وفقًا لحالة المرض، باستثناء حالة إعلان واحدة ذات خصائص تشبه التحكم. من بين هذه البروتينات الـ 65، زاد 63 بروتينًا في مرض الزهايمر، بينما انخفض اثنان فقط (CD74 وISLR). في المجمل، حددت تحليلات السائل النخاعي مئات البروتينات في مرض الزهايمر والتي قد تكون بمثابة مؤشرات حيوية للمرض.
ثم أجرينا تحليلًا مستقلاً لشبكة بروتين الدماغ AD. شملت مجموعة الدماغ لهذا الاكتشاف القشرة الجبهية الظهرية الجانبية (DLPFC) من السيطرة (ن = 10)، ومرض باركنسون (PD؛ ن = 10)، وحالات AD/PD المختلطة (ن = 10) وحالات AD (ن = 10). ) عينة. ايمري جويزويتا ADRC. تم وصف التركيبة السكانية لهذه الحالات الأربعين مسبقًا (25) وتم تلخيصها في الجدول S1B. استخدمنا TMT-MS لتحليل أنسجة المخ الأربعين ومجموعة النسخ المتماثل المكونة من 27 حالة. في المجمل، أنتجت مجموعتا بيانات الدماغ هاتين 227,121 ببتيدًا فريدًا، والتي تم ربطها بـ 12,943 بروتينًا (25). تم تضمين فقط تلك البروتينات التي تم قياسها كميًا في 50٪ على الأقل من الحالات في التحقيقات اللاحقة. تحتوي مجموعة بيانات الاكتشاف النهائية على 8817 بروتينًا كميًا. ضبط مستويات وفرة البروتين على أساس العمر والجنس والفاصل الزمني بعد الوفاة (PMI). أظهر تحليل التعبير التفاضلي لمجموعة البيانات بعد الانحدار أن مستويات البروتين> 2000 قد تغيرت بشكل كبير [P <0.05، تحليل التباين (ANOVA)] في مجموعتين أو أكثر من الأمراض. بعد ذلك، أجرينا تحليلًا عنقوديًا خاضعًا للإشراف استنادًا إلى البروتينات المعبر عنها تفاضليًا، وP <0.0001 في مقارنات AD/التحكم و/أو AD/PD (الشكل S2 وA وB، الجدول S2C). تصور هذه البروتينات الـ 165 التي تم تغييرها بشكل كبير حالات مرض الزهايمر من عينات التحكم وعينات PD، مما يؤكد التغييرات القوية الخاصة بمرض الزهايمر في البروتين بأكمله.
استخدمنا بعد ذلك خوارزمية تسمى تحليل شبكة التعبير الجيني الموزون (WGCNA) لإجراء تحليل الشبكة على بروتينات الدماغ المكتشفة، والتي تنظم مجموعة البيانات في وحدات بروتينية ذات أنماط تعبير مماثلة (11-13). حدد التحليل 44 وحدة (M) من البروتينات التي يتم التعبير عنها بشكل مشترك، مرتبة ومرقمة من الأكبر (M1، n = 1821 بروتينات) إلى الأصغر (M44، n = 34 بروتينات) (الشكل 2A والجدول S2D)). كما هو مذكور أعلاه (13) حساب ملف تعريف التعبير التمثيلي أو البروتين المميز لكل وحدة، وربطه بحالة المرض وعلم الأمراض AD، أي إنشاء تحالف سجل مرض الزهايمر (CERAD) ونقاط براك (الشكل 2B). بشكل عام، كانت 17 وحدة مرتبطة بشكل كبير بعلم الأمراض العصبية AD (P <0.05). العديد من هذه الوحدات المرتبطة بالأمراض غنية أيضًا بالعلامات الخاصة بنوع الخلية (الشكل 2ب). كما هو مذكور أعلاه (13)، يتم تحديد إثراء نوع الخلية من خلال تحليل تداخل الوحدة النمطية والقائمة المرجعية للجينات الخاصة بنوع الخلية. هذه الجينات مستمدة من البيانات المنشورة في الخلايا العصبية الفأرية المعزولة، والخلايا البطانية والدبقية. تجربة تسلسل الحمض النووي الريبي (RNA-seq) (29).
(أ) اكتشف WGCNA لبروتين الدماغ. (ب) تحليل الارتباط المتوسط ​​ثنائي الوزن (BiCor) لبروتين التوقيع المعياري (المكون الرئيسي الأول للتعبير البروتيني المعياري) مع الخصائص المرضية العصبية (أعلى)، بما في ذلك درجات CERAD (لوحة Aβ) وBraak (تشابكات تاو). تظهر شدة الارتباطات الإيجابية (الحمراء) والسلبية (الزرقاء) من خلال خريطة حرارية ذات لونين، وتشير العلامات النجمية إلى أهمية إحصائية (P <0.05). استخدم اختبار فيشر الدقيق (FET) (أسفل) لتقييم ارتباط نوع الخلية لكل وحدة بروتين. تشير شدة التظليل الأحمر إلى درجة إثراء نوع الخلية، وتشير العلامة النجمية إلى الأهمية الإحصائية (P <0.05). استخدم طريقة BH لتصحيح القيمة P المستمدة من FET. (ج) تحليل GO للبروتينات المعيارية. يتم عرض العمليات البيولوجية الأكثر ارتباطًا بكل وحدة أو مجموعة وحدات ذات صلة. قليله، قليله التغصن.
وأظهرت مجموعة من خمس وحدات الخلايا النجمية والخلايا الدبقية الصغيرة ذات الصلة الوثيقة (M30، M29، M18، M24، وM5) وجود علاقة إيجابية قوية مع علم الأمراض العصبية م (الشكل 2B). يربط تحليل الوجود هذه الوحدات الدبقية بنمو الخلايا وانتشارها والمناعة (الشكل 2C والجدول S2E). يتم أيضًا تنظيم وحدتين دبقيتين إضافيتين، M8 وM22، بقوة في المرض. يرتبط M8 ارتباطًا وثيقًا بمسار المستقبل الشبيه بـ Toll، وهو سلسلة إشارات تلعب دورًا رئيسيًا في الاستجابة المناعية الفطرية (30). وفي الوقت نفسه، يرتبط M22 ارتباطًا وثيقًا بتعديل ما بعد الترجمة. يُظهر M2، الغني بالخلايا قليلة التغصن، علاقة إيجابية قوية مع مرض الزهايمر واتصال وجودي مع تخليق النيوكليوسيد وتكرار الحمض النووي، مما يشير إلى تكاثر الخلايا المعزز في الأمراض. بشكل عام، تدعم هذه النتائج ارتفاع الوحدات الدبقية التي لاحظناها سابقًا في بروتينات شبكة AD (13، 17). لقد وجد حاليًا أن العديد من الوحدات الدبقية المرتبطة بـ AD في الشبكة تظهر مستويات تعبير أقل في حالات التحكم وحالات PD، مما يسلط الضوء على خصوصية المرض المرتفعة في AD (الشكل S2C).
ترتبط أربع وحدات فقط في بروتين شبكتنا (M1 وM3 وM10 وM32) سلبًا بشدة بعلم الأمراض AD (P <0.05) (الشكل 2 وB وC). كل من M1 وM3 غنيان بالعلامات العصبية. يرتبط M1 بشكل كبير بالإشارات المشبكية، بينما يرتبط M3 ارتباطًا وثيقًا بوظيفة الميتوكوندريا. لا يوجد أي دليل على إثراء نوع الخلية لـ M10 وM32. يعكس M32 العلاقة بين M3 واستقلاب الخلية، بينما يرتبط M10 بشكل كبير بنمو الخلايا ووظيفة الأنابيب الدقيقة. بالمقارنة مع مرض الزهايمر، يتم زيادة جميع الوحدات الأربع في التحكم و PD، مما يمنحهم تغييرات مرضية محددة (الشكل S2C). بشكل عام، تدعم هذه النتائج انخفاض وفرة الوحدات الغنية بالخلايا العصبية التي لاحظناها سابقًا في م (13، 17). باختصار، أدى تحليل شبكة بروتين الدماغ الذي اكتشفناه إلى إنتاج وحدات معدلة خصيصًا لمرض الزهايمر تتوافق مع النتائج السابقة التي توصلنا إليها.
يتميز مرض الزهايمر بمرحلة مبكرة بدون أعراض (AsymAD)، حيث يظهر الأفراد تراكم الأميلويد دون تدهور إدراكي سريري (5، 31). تمثل هذه المرحلة بدون أعراض نافذة حاسمة للكشف والتدخل المبكر. لقد أظهرنا سابقًا الحفاظ على وحدات قوية لبروتينات شبكة الدماغ AsymAD وAD عبر مجموعات البيانات المستقلة (13، 17). من أجل التأكد من أن شبكة الدماغ التي اكتشفناها حاليًا متوافقة مع هذه النتائج السابقة، قمنا بتحليل الحفاظ على 44 وحدة في مجموعة البيانات المنسوخة من 27 منظمة DLPFC. تتضمن هذه المنظمات حالات التحكم (n = 10)، وحالات AsymAD (n = 8) وحالات AD (n = 9). تم تضمين عينات التحكم و AD في تحليل مجموعة اكتشاف الدماغ لدينا (الجدول S1B)، في حين كانت حالات AsymAD فريدة فقط في مجموعة النسخ المتماثل. جاءت حالات AsymAD هذه أيضًا من بنك الدماغ Emory Goizueta ADRC. على الرغم من أن الإدراك كان طبيعيًا في وقت الوفاة، إلا أن مستويات الأميلويد كانت مرتفعة بشكل غير طبيعي (يعني CERAD، 2.8 ± 0.5) (الجدول S1B).
أدى تحليل TMT-MS لأنسجة المخ الـ 27 إلى القياس الكمي لـ 11244 بروتينًا. يتضمن هذا العدد النهائي فقط تلك البروتينات التي تم قياسها كمياً في 50% على الأقل من العينات. تحتوي مجموعة البيانات المكررة هذه على 8638 (98.0%) من 8817 بروتينًا تم اكتشافها في تحليلنا للدماغ الاكتشافي، وتحتوي على ما يقرب من 3000 بروتين تم تغييره بشكل ملحوظ بين مجموعات التحكم ومجموعات AD (P <0.05، بعد اختبار Tukey المقترن t لتحليل التباين) ( الجدول S2F). من بين هذه البروتينات المعبر عنها تفاضليًا، أظهر 910 أيضًا تغيرات كبيرة في المستوى بين حالات التحكم في بروتينات AD والدماغ (P <0.05، بعد اختبار ANOVA Tukey المقترن t). تجدر الإشارة إلى أن علامات 910 هذه متسقة للغاية في اتجاه التغيير بين البروتينات (r = 0.94، P <1.0 × 10-200) (الشكل S3A). من بين البروتينات المتزايدة، البروتينات ذات التغييرات الأكثر اتساقًا بين مجموعات البيانات هي بشكل أساسي أعضاء في وحدات M5 وM18 الغنية بالدبقية (MDK، COL25A1، MAPT، NTN1، SMOC1، وGFAP). من بين البروتينات المختزلة، كان أولئك الذين لديهم تغييرات أكثر اتساقًا تقريبًا أعضاء في وحدة M1 (NPTX2 وVGF وRPH3A) المرتبطة بالمشبك العصبي. لقد تحققنا أيضًا من التغييرات المرتبطة بـ AD في midkine (MDK) و CD44 والبروتين المرتبط بالشعر المجعد 1 (SFRP1) و VGF بواسطة النشاف الغربي (الشكل S3B). أظهر تحليل الحفاظ على الوحدة أن حوالي 80٪ من وحدات البروتين (34/44) في بروتين الدماغ تم حفظها بشكل كبير في مجموعة بيانات النسخ المتماثل (z-score> 1.96، FDR صحح P <0.05) (الشكل S3C). تم حجز أربعة عشر من هذه الوحدات خصيصًا بين البروتينين (z-score> 10، FDR مصحح P <1.0 × 10−23). بشكل عام، فإن اكتشاف وتكرار الدرجة العالية من الاتساق في التعبير التفاضلي والتركيب المعياري بين بروتينات الدماغ يسلط الضوء على إمكانية تكرار التغييرات في بروتينات القشرة الأمامية AD. بالإضافة إلى ذلك، فقد أكدت أيضًا أن AsymAD والأمراض الأكثر تقدمًا لها بنية شبكة دماغية متشابهة جدًا.
يسلط تحليل أكثر تفصيلاً للتعبير التفاضلي في مجموعة بيانات تكرار الدماغ الضوء على الدرجة الكبيرة من تغيرات بروتين AsymAD، بما في ذلك ما مجموعه 151 بروتينًا تم تغييره بشكل كبير بين AsymAD والتحكم (P <0.05) (الشكل S3D). تمشيًا مع حمل الأميلويد، زاد APP في دماغ AsymAD وAD بشكل ملحوظ. يتغير MAPT بشكل ملحوظ فقط في مرض الزهايمر، وهو ما يتوافق مع زيادة مستويات التشابك وارتباطه المعروف بالتدهور المعرفي (5، 7). تنعكس الوحدات الغنية بالدبقية (M5 وM18) بشكل كبير في البروتينات المتزايدة في AsymAD، في حين أن وحدة M1 المرتبطة بالخلايا العصبية هي الأكثر تمثيلاً للبروتينات المنخفضة في AsymAD. تظهر العديد من علامات AsymAD تغيرات أكبر في الأمراض المصحوبة بأعراض. ومن بين هذه العلامات SMOC1، وهو بروتين دبقي ينتمي إلى M18، والذي يرتبط بأورام المخ وتطور العيون والأطراف (32). MDK هو عامل نمو مرتبط بالهيبارين ويرتبط بنمو الخلايا وتولد الأوعية (33)، وهو عضو آخر في M18. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، زاد AsymAD بشكل ملحوظ، تليها زيادة أكبر في مرض الزهايمر. في المقابل، انخفض البروتين المتشابك نيوروبينتراكسين 2 (NPTX2) بشكل ملحوظ في دماغ AsymAD. كان NPTX2 مرتبطًا سابقًا بالتنكس العصبي وله دور معترف به في التوسط في المشابك العصبية المثيرة (34). بشكل عام، تكشف هذه النتائج عن مجموعة متنوعة من التغيرات البروتينية المختلفة قبل السريرية في مرض الزهايمر والتي يبدو أنها تتقدم مع شدة المرض.
نظرًا لأننا حققنا عمقًا كبيرًا في تغطية البروتين في اكتشاف بروتين الدماغ، فإننا نحاول أن نفهم بشكل أكمل تداخله مع نسخة AD النصية على مستوى الشبكة. لذلك، قمنا بمقارنة بروتين الدماغ الذي اكتشفناه مع الوحدة التي أنشأناها سابقًا من قياس المصفوفة الدقيقة لـ 18204 جينًا في AD (ن = 308) والتحكم (ن = 157) في أنسجة DLPFC (13). متداخلة. في المجموع، حددنا 20 وحدات مختلفة من الحمض النووي الريبي (RNA)، أظهر الكثير منها إثراء أنواع معينة من الخلايا، بما في ذلك الخلايا العصبية، والخلايا الدبقية قليلة التغصن، والخلايا النجمية، والخلايا الدبقية الصغيرة (الشكل 3A). وتظهر التغييرات المتعددة لهذه الوحدات في م في الشكل 3B. تماشيًا مع تحليلنا السابق لتداخل البروتين-RNA باستخدام بروتين MS الأعمق غير المسمى (حوالي 3000 بروتين) (13)، فإن معظم الوحدات الـ 44 في شبكة بروتينات الدماغ التي وجدناها موجودة في شبكة النسخ، ولا يوجد تداخل كبير فيها. أثبت اكتشافنا وتكرارنا لوحدات البروتين الـ 34 التي تم الاحتفاظ بها بشكل كبير في بروتين الدماغ، أن 14 وحدة فقط (~ 40٪) اجتازت اختبار فيشر الدقيق (FET) أثبت أن لها تداخلًا ذو دلالة إحصائية مع النسخة (الشكل 3A). متوافق مع إصلاح تلف الحمض النووي (P-M25 وP-M19)، وترجمة البروتين (P-M7 وP-M20)، وربط/ربط الحمض النووي الريبي (P-M16 وP-M21) واستهداف البروتين (P-M13 وP- M23) لا يتداخل مع الوحدات الموجودة في النص. لذلك، على الرغم من استخدام مجموعة بيانات بروتينية أعمق في تحليل التداخل الحالي (13)، لم يتم تعيين معظم بروتينات شبكة AD إلى شبكة النسخ.
(أ) يُظهر FET الهندسي الفائق إثراء العلامات الخاصة بنوع الخلية في وحدة الحمض النووي الريبي (RNA) للنسخة الإعلانية (أعلى) ودرجة التداخل بين وحدات الحمض النووي الريبي (المحور السيني) والبروتين (المحور الصادي) للدماغ الإعلاني. (قاع) . تشير شدة التظليل الأحمر إلى درجة إثراء أنواع الخلايا في اللوحة العلوية وشدة تداخل الوحدات في اللوحة السفلية. تشير العلامات النجمية إلى أهمية إحصائية (P <0.05). (ب) درجة الارتباط بين الجينات المميزة لكل وحدة نسخة وحالة الإعلان. الوحدات الموجودة على اليسار هي الأكثر ارتباطًا بشكل سلبي بـ AD (الأزرق)، وتلك الموجودة على اليمين هي الأكثر ارتباطًا بشكل إيجابي بـ AD (الأحمر). تشير قيمة P المصححة بـ BH المحولة بالسجل إلى درجة الأهمية الإحصائية لكل ارتباط. (ج) وحدات متداخلة كبيرة مع إثراء نوع الخلية المشتركة. (د) تحليل الارتباط لتغيير أضعاف log2 للبروتين المسمى (المحور السيني) والحمض النووي الريبي (المحور الصادي) في الوحدة النمطية المتداخلة. يتم عرض معامل ارتباط بيرسون مع قيمة P ذات الصلة. مايكرو، الخلايا الدبقية الصغيرة. الأجرام السماوية والخلايا النجمية. CT، السيطرة.
تشترك معظم وحدات البروتين والحمض النووي الريبي (RNA) المتداخلة في ملفات تعريف مماثلة لنوع الخلية واتجاهات تغيير AD متسقة (الشكل 3، B وC). بمعنى آخر، تم تعيين وحدة M1 المرتبطة بالمشبك العصبي لبروتين الدماغ (PM1) إلى ثلاث وحدات RNA متماثلة غنية بالخلايا العصبية (R-M1، وR-M9، وR-M16)، والتي تظهر في كل منهما. مستوى مخفض. وبالمثل، تتداخل وحدات البروتين M5 وM18 الغنية بالدبقية مع وحدات الحمض النووي الريبي (RNA) الغنية بالخلايا النجمية وعلامات الخلايا الدبقية الصغيرة (R-M3، R-M7، وR-M10) وتشترك بشكل كبير في زيادة الأمراض. تدعم هذه الميزات المعيارية المشتركة بين مجموعتي البيانات إثراء نوع الخلية والتغيرات المرتبطة بالأمراض التي لاحظناها في بروتين الدماغ. ومع ذلك، لاحظنا العديد من الاختلافات الهامة بين مستويات الحمض النووي الريبي (RNA) والبروتين للعلامات الفردية في هذه الوحدات المشتركة. تحليل الارتباط للتعبير التفاضلي للبروتينات والنسخ من الجزيئات داخل هذه الوحدات المتداخلة (الشكل 3D) يسلط الضوء على هذا التناقض. على سبيل المثال، أظهر APP والعديد من بروتينات الوحدة الدبقية الأخرى (NTN1، MDK، COL25A1، ICAM1، وSFRP1) زيادة كبيرة في بروتين AD، ولكن لم يكن هناك أي تغيير تقريبًا في نسخة AD. قد تكون هذه التغييرات الخاصة بالبروتين مرتبطة ارتباطًا وثيقًا بلويحات الأميلويد (23، 35)، مما يسلط الضوء على البروتين كمصدر للتغيرات المرضية، وقد لا تنعكس هذه التغييرات في النسخة النصية.
بعد التحليل المستقل لبروتينات الدماغ وبروتينات CSF التي اكتشفناها، أجرينا تحليلًا شاملاً لمجموعتي البيانات لتحديد المؤشرات الحيوية لـ AD CSF المتعلقة بالفيزيولوجيا المرضية لشبكة الدماغ. يجب علينا أولاً تحديد التداخل بين البروتينين. على الرغم من أنه من المقبول على نطاق واسع أن CSF يعكس التغيرات الكيميائية العصبية في دماغ AD (4)، إلا أن درجة التداخل الدقيقة بين دماغ AD وبروتين CSF غير واضحة. من خلال مقارنة عدد منتجات الجينات المشتركة المكتشفة في اثنين من البروتينات لدينا، وجدنا أن ما يقرب من 70٪ (ن = 1936) من البروتينات المحددة في السائل النخاعي تم قياسها أيضًا كميًا في الدماغ (الشكل 4A). يتم تعيين معظم هذه البروتينات المتداخلة (ن = 1721) إلى واحدة من 44 وحدة تعبير مشترك من مجموعة بيانات اكتشاف الدماغ (الشكل 4 ب). كما هو متوقع، أظهرت وحدات الدماغ الست الأكبر (من M1 إلى M6) أكبر قدر من تداخل السائل الدماغي الشوكي. ومع ذلك، هناك وحدات دماغية أصغر (على سبيل المثال، M15 وM29) تحقق درجة عالية من التداخل بشكل غير متوقع، أكبر من وحدة الدماغ ضعف حجمها. وهذا يحفزنا على اعتماد طريقة أكثر تفصيلاً وإحصائية لحساب التداخل بين الدماغ والسائل النخاعي.
(أ و ب) تتداخل البروتينات المكتشفة في مجموعات بيانات دماغ الاكتشاف والسائل الدماغي الشوكي. ترتبط معظم هذه البروتينات المتداخلة بواحدة من وحدات التعبير المشترك البالغ عددها 44 وحدة في شبكة التعبير المشترك في الدماغ. (ج) اكتشف التداخل بين بروتين السائل النخاعي وبروتين شبكة الدماغ. يمثل كل صف من الخريطة الحرارية تحليل تداخل منفصل لـ FET الهندسي الفائق. يصور الصف العلوي التداخل (التظليل الرمادي/الأسود) بين وحدة الدماغ وبروتين CSF بأكمله. يصور السطر الثاني أن التداخل بين وحدات المخ وبروتين CSF (مظلل باللون الأحمر) يتم تنظيمه بشكل كبير في م (P <0.05). يوضح الصف الثالث أن التداخل بين وحدات المخ وبروتين CSF (التظليل الأزرق) يتم تنظيمه بشكل كبير في م (P <0.05). استخدم طريقة BH لتصحيح القيمة P المستمدة من FET. (D) لوحة وحدة قابلة للطي تعتمد على ارتباط نوع الخلية ومصطلحات GO ذات الصلة. تحتوي هذه اللوحات على إجمالي 271 بروتينًا مرتبطًا بالدماغ، والتي لها تعبير تفاضلي ذو معنى في بروتين CSF.
باستخدام FETs أحادية الذيل، قمنا بتقييم أهمية تداخل البروتين بين بروتينات CSF ووحدات الدماغ الفردية. وكشف التحليل أن ما مجموعه 14 وحدة دماغية في مجموعة بيانات CSF لها تداخلات ذات دلالة إحصائية (تعديل FDR P <0.05)، ووحدة نمطية إضافية (M18) التي يقترب تداخلها من الأهمية (FDR تعديل P = 0.06) (الشكل 4C) ، الصف العلوي). نحن مهتمون أيضًا بالوحدات التي تتداخل بشدة مع بروتينات CSF المعبر عنها تفاضليًا. لذلك ، قمنا بتطبيق تحليلين إضافيين لـ FET لتحديد أي من (i) بروتين CSF قد زاد بشكل كبير في AD و (ii) انخفض بروتين CSF بشكل ملحوظ في AD (P <0.05 ، اختبار t مقترن AD / control) وحدات الدماغ مع تداخل ذي معنى بينهما. كما هو موضح في الصفوف الوسطى والسفلية من الشكل 4C، تظهر هذه التحليلات الإضافية أن 8 من وحدات الدماغ الـ 44 تتداخل بشكل كبير مع البروتين المضاف في AD CSF (M12، M1، M2، M18، M5، M44، M33، وM38) . )، في حين أظهرت وحدتان فقط (M6 وM15) تداخلًا ذا مغزى مع البروتين المنخفض في AD CSF. كما هو متوقع، جميع الوحدات العشر موجودة في 15 وحدة ذات أعلى تداخل مع بروتين CSF. ولذلك، فإننا نفترض أن هذه الوحدات الخمس عشرة هي مصادر عالية الإنتاجية للمؤشرات الحيوية للسائل الدماغي الشوكي المشتقة من الدماغ.
قمنا بطي هذه الوحدات الـ 15 المتداخلة في خمس ألواح بروتينية كبيرة بناءً على قربها من مخطط شجرة WGCNA وارتباطها بأنواع الخلايا وعلم الجينات (الشكل 4D). تحتوي اللوحة الأولى على وحدات غنية بعلامات الخلايا العصبية والبروتينات المرتبطة بالمشابك العصبية (M1 وM12). تحتوي اللوحة المشبكية على إجمالي 94 بروتينًا، وقد تغيرت المستويات في بروتين CSF بشكل ملحوظ، مما يجعلها أكبر مصدر لعلامات CSF المرتبطة بالدماغ بين اللوحات الخمس. أظهرت المجموعة الثانية (M6 وM15) الارتباط الوثيق مع علامات الخلايا البطانية والجسم الوعائي، مثل "التئام الجروح" (M6) و"تنظيم الاستجابة المناعية الخلطية" (M15). يرتبط M15 أيضًا بشكل كبير باستقلاب البروتين الدهني، والذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالبطانة (36). تحتوي اللوحة الوعائية على 34 علامة CSF مرتبطة بالدماغ. تتضمن المجموعة الثالثة وحدات (M2 وM4) ترتبط بشكل كبير بعلامات الخلايا قليلة التغصن وتكاثر الخلايا. على سبيل المثال، تتضمن مصطلحات علم الوجود ذات المستوى الأعلى لـ M2 "التنظيم الإيجابي لتكرار الحمض النووي" و"عملية التخليق الحيوي للبيورين". وفي الوقت نفسه، تشمل تلك الموجودة في M4 "تمايز الخلايا الدبقية" و"فصل الكروموسومات". تحتوي لوحة الميالين على 49 علامة CSF مرتبطة بالدماغ.
تحتوي المجموعة الرابعة على معظم الوحدات (M30، M29، M18، M24، وM5)، وجميع الوحدات تقريبًا غنية بشكل كبير بالخلايا الدبقية الصغيرة وعلامات الخلايا النجمية. على غرار لوحة الميالين، تحتوي اللوحة الرابعة أيضًا على وحدات (M30 وM29 وM18) ترتبط ارتباطًا وثيقًا بتكاثر الخلايا. ترتبط الوحدات الأخرى في هذه المجموعة بشكل كبير بالمصطلحات المناعية، مثل "عملية التأثير المناعي" (M5) و"تنظيم الاستجابة المناعية" (M24). تحتوي المجموعة المناعية الدبقية على 42 علامة CSF مرتبطة بالدماغ. أخيرًا، تتضمن اللوحة الأخيرة 52 علامة مرتبطة بالدماغ على الوحدات الأربع (M44، M3، M33، وM38)، وكلها على الجسم تتعلق بتخزين الطاقة والتمثيل الغذائي. ترتبط أكبر هذه الوحدات (M3) ارتباطًا وثيقًا بالميتوكوندريا وهي غنية بالعلامات الخاصة بالخلايا العصبية. M38 هو أحد أعضاء الوحدة الأصغر في هذا التمثيل الغذائي ويظهر أيضًا خصوصية عصبية معتدلة.
بشكل عام، تعكس هذه اللوحات الخمس نطاقًا واسعًا من أنواع الخلايا ووظائفها في القشرة AD، وتحتوي مجتمعة على 271 علامة CSF مرتبطة بالدماغ (الجدول S2G). من أجل تقييم صحة نتائج مرض التصلب العصبي المتعدد هذه، استخدمنا مقايسة تمديد القرب (PEA)، وهي تقنية قائمة على الأجسام المضادة المتعامدة مع قدرات تعدد الإرسال، وحساسية وخصوصية عالية، وأعدنا تحليل عينات السائل النخاعي التي وجدناها مجموعة فرعية من هذه المؤشرات الحيوية البالغ عددها 271 (ن = 36). توضح هذه الأهداف الـ 36 التغير في مضاعف AD لـ PEA، والذي يرتبط ارتباطًا وثيقًا بالنتائج المستندة إلى MS (r = 0.87، P = 5.6 × 10-12)، والتي تحققت بقوة من نتائج تحليلنا الشامل لمرض التصلب العصبي المتعدد (الشكل S4) ).
المواضيع البيولوجية التي أكدت عليها مجموعاتنا الخمس، من الإشارات المشبكية إلى استقلاب الطاقة، كلها مرتبطة بإمراض مرض الزهايمر (1-3). ولذلك، ترتبط جميع الوحدات الـ 15 التي تحتوي على هذه اللوحات بعلم الأمراض في بروتين الدماغ الذي اكتشفناه (الشكل 2ب). أبرزها هو الارتباط المرضي الإيجابي العالي بين الوحدات الدبقية لدينا والارتباط المرضي السلبي القوي بين أكبر الوحدات العصبية لدينا (M1 وM3). يسلط تحليل التعبير التفاضلي لبروتينات الدماغ المكررة (الشكل S3D) الضوء أيضًا على البروتينات الدبقية المشتقة من M5 وM18. في AsymAD ومرض الزهايمر المصحوب بأعراض، تكون البروتينات الدبقية الأكثر زيادة والمشابك العصبية المرتبطة بـ M1 هي الأكثر انخفاضًا. تشير هذه الملاحظات إلى أن علامات السائل النخاعي الـ 271 التي حددناها في المجموعات الخمس مرتبطة بعمليات المرض في القشرة الدماغية، بما في ذلك تلك التي تحدث في المراحل المبكرة بدون أعراض.
من أجل تحليل اتجاه التغير في بروتينات اللوحة بشكل أفضل في الدماغ والسائل الشوكي، قمنا برسم ما يلي لكل وحدة من الوحدات الـ 15 المتداخلة: (1) العثور على مستوى وفرة الوحدة في مجموعة بيانات الدماغ و (2) الوحدة البروتين يتم التعبير عن الفرق في السائل النخاعي (الشكل S5). كما ذكرنا سابقًا، يتم استخدام WGCNA لتحديد وفرة الوحدة أو قيمة البروتين المميزة في الدماغ (13). تُستخدم خريطة البركان لوصف التعبير التفاضلي للبروتينات المعيارية في السائل النخاعي (AD/التحكم). توضح هذه الأشكال أن ثلاثًا من اللوحات الخمس تظهر اتجاهات تعبير مختلفة في الدماغ والسائل الشوكي. تظهر وحدتي لوحة المشبك (M1 وM12) انخفاضًا في مستوى الوفرة في دماغ AD، لكن تتداخل بشكل كبير مع البروتين المتزايد في AD CSF (الشكل S5A). أظهرت الوحدات المرتبطة بالخلايا العصبية التي تحتوي على المستقلب (M3 وM38) أنماطًا مماثلة للتعبير عن السائل النخاعي والدماغي غير متناسقة (الشكل S5E). أظهرت لوحة الأوعية الدموية أيضًا اتجاهات تعبير مختلفة، على الرغم من أن وحداتها (M6 وM15) زادت بشكل معتدل في الدماغ AD وانخفضت في CSF المريضة (الشكل S5B). تحتوي اللوحين المتبقيين على شبكات دبقية كبيرة يتم تنظيم بروتيناتها باستمرار في كلا الجزأين (الشكل S5 وC وD).
يرجى ملاحظة أن هذه الاتجاهات ليست مشتركة بين جميع العلامات الموجودة في هذه اللوحات. على سبيل المثال، تشتمل اللوحة المتشابكة على العديد من البروتينات التي يتم تقليلها بشكل كبير في دماغ AD وCSF (الشكل S5A). ومن بين علامات السائل النخاعي الخاضعة للتنظيم NPTX2 وVGF لـ M1، والكروموغرانين B لـ M12. ومع ذلك، على الرغم من هذه الاستثناءات، فإن معظم علامات التشابك العصبي لدينا مرتفعة في السائل الشوكي AD. وبشكل عام، تمكنت هذه التحليلات من التمييز بين الاتجاهات ذات الدلالة الإحصائية في مستويات الدماغ والسائل النخاعي في كل لوحة من لوحاتنا الخمس. تسلط هذه الاتجاهات الضوء على العلاقة المعقدة والمختلفة غالبًا بين تعبير بروتين الدماغ والسائل الدماغي الشوكي في مرض الزهايمر.
بعد ذلك، استخدمنا تحليل تكرار مرض التصلب العصبي المتعدد عالي الإنتاجية (نسخ CSF 1) لتضييق نطاق مجموعة المؤشرات الحيوية البالغ عددها 271 إلى الأهداف الواعدة والقابلة للتكرار (الشكل 5A). تحتوي نسخة CSF 1 على إجمالي 96 عينة من Emory Goizueta ADRC، بما في ذلك مجموعة التحكم وAsymAD وAD (الجدول S1A). تتميز حالات مرض الزهايمر هذه بتدهور إدراكي معتدل (يعني MoCA، 20.0 ± 3.8)، والتغيرات في المؤشرات الحيوية لمرض الزهايمر المؤكدة في السائل النخاعي (الجدول S1A). على عكس تحليل CSF الذي وجدناه، يتم إجراء هذا النسخ المتماثل باستخدام طريقة MS "طلقة واحدة" أكثر كفاءة وعالية الإنتاجية (بدون تجزئة خارج الخط)، بما في ذلك بروتوكول إعداد العينة المبسط الذي يلغي الحاجة إلى الاستنزاف المناعي للعينات الفردية . وبدلاً من ذلك، يتم استخدام "قناة تعزيز" واحدة مستنفدة للمناعة لتضخيم إشارة البروتينات الأقل وفرة (37). على الرغم من أنه يقلل من إجمالي التغطية البروتينية، فإن طريقة اللقطة الواحدة هذه تقلل بشكل كبير من وقت الآلة وتزيد من عدد العينات التي تحمل علامة TMT والتي يمكن تحليلها بشكل قابل للتطبيق (17، 38). في المجمل، حدد التحليل 6,487 ببتيدًا، والتي تم تعيينها لـ 1,183 بروتينًا في 96 حالة. كما هو الحال مع تحليل CSF الذي وجدناه، تم تضمين فقط تلك البروتينات التي تم قياسها كميًا في 50٪ على الأقل من العينات في الحسابات اللاحقة، وتم تراجع البيانات بالنسبة لتأثيرات العمر والجنس. وأدى ذلك إلى التحديد الكمي النهائي لـ 792 بروتينًا، تم تحديد 95% منها أيضًا في مجموعة بيانات CSF الموجودة.
(أ) تم التحقق من أهداف بروتين CSF المرتبطة بالدماغ في أول مجموعة CSF المكررة وتم تضمينها في اللوحة النهائية (ن = 60). (B إلى E) مستويات العلامات الحيوية للوحة (درجات z المركبة) المقاسة في مجموعات النسخ المتماثل الأربعة لـ CSF. تم استخدام اختبارات t المقترنة أو ANOVA مع تصحيح Tukey اللاحق لتقييم الأهمية الإحصائية للتغيرات في الوفرة في كل تحليل متكرر. CT، السيطرة.
نظرًا لأننا مهتمون بشكل خاص بالتحقق من أهداف CSF المتعلقة بالدماغ البالغ عددها 271 هدفًا من خلال التحليل الشامل، فسوف نقتصر إجراء مزيد من الفحص لهذا البروتين المكرر على هذه العلامات. من بين هذه البروتينات الـ 271، تم اكتشاف 100 منها في تكرار CSF 1. يوضح الشكل S6A التعبير التفاضلي لهذه العلامات المتداخلة المائة بين عينات التحكم وعينات النسخ المتماثل AD. تزيد الهستونات المشبكية والأيضية بشكل أكبر في مرض الزهايمر، بينما تنخفض البروتينات الوعائية بشكل أكبر في المرض. حافظت معظم العلامات المتداخلة المائة (ن = 70) على نفس اتجاه التغيير في مجموعتي البيانات (الشكل S6B). تعكس علامات CSF السبعين المرتبطة بالدماغ (الجدول S2H) إلى حد كبير اتجاهات تعبير اللوحة التي تمت ملاحظتها مسبقًا، أي التنظيم السفلي لبروتينات الأوعية الدموية والتنظيم الأعلى لجميع اللوحات الأخرى. أظهرت 10 فقط من هذه البروتينات السبعين التي تم التحقق من صحتها تغيرات في وفرة AD التي تتعارض مع اتجاهات اللوحة هذه. من أجل إنشاء لوحة تعكس الاتجاه العام للدماغ والسائل النخاعي على أفضل وجه، استبعدنا هذه البروتينات العشرة من اللوحة محل الاهتمام التي تحققنا منها أخيرًا (الشكل 5A). ولذلك، يتضمن فريقنا في النهاية ما مجموعه 60 بروتينًا تم التحقق منها في مجموعتين مستقلتين من CSF AD باستخدام إعداد عينات مختلف وتحليل منصة MS. أكدت مؤامرات التعبير z-score لهذه اللوحات النهائية في التحكم في نسخة CSF 1 وحالات AD اتجاه اللوحة الذي لوحظ في مجموعة CSF التي وجدناها (الشكل 5B).
من بين هذه البروتينات الستين، هناك جزيئات معروفة بأنها مرتبطة بمرض الزهايمر، مثل أوستيوبونتين (SPP1)، وهو سيتوكين مؤيد للالتهابات ارتبط بمرض الزهايمر في العديد من الدراسات (39-41)، وGAP43، وهو بروتين متشابك. يرتبط بشكل واضح بالتنكس العصبي (42). البروتينات الأكثر التحقق منها بالكامل هي علامات مرتبطة بأمراض تنكس عصبي أخرى، مثل التصلب الجانبي الضموري (ALS) المرتبط بأكسيد الفائق ديسموتاز 1 (SOD1) ومرض باركنسون المرتبط بمرض باركنسون (PARK7) . لقد تحققنا أيضًا من أن العديد من العلامات الأخرى، مثل SMOC1 وبروتين الإشارة المرتبط بالغشاء الغني بالدماغ 1 (BASP1)، كانت لها روابط سابقة محدودة بالتنكس العصبي. تجدر الإشارة إلى أنه نظرًا لانخفاض وفرتها الإجمالية في بروتين CSF، فمن الصعب علينا استخدام طريقة الكشف ذات اللقطة الواحدة عالية الإنتاجية هذه للكشف بشكل موثوق عن MAPT وبعض البروتينات الأخرى المرتبطة بـ AD (على سبيل المثال، NEFL وNRGN) ) (43، 44).
قمنا بعد ذلك بفحص علامات لوحة الأولوية الستين هذه في ثلاثة تحليلات متكررة إضافية. في CSF Copy 2، استخدمنا TMT-MS واحدًا لتحليل مجموعة مستقلة مكونة من 297 عينة تحكم وعينات AD من Emory Goizueta ADRC (17). تضمن تكرار CSF 3 إعادة تحليل بيانات TMT-MS المتاحة من 120 مريضًا من مجموعة المراقبة ومرضى مرض الزهايمر من لوزان، سويسرا (45). لقد اكتشفنا أكثر من ثلثي علامات الأولوية الستين في كل مجموعة بيانات. على الرغم من أن الدراسة السويسرية استخدمت منصات مختلفة لمرض التصلب العصبي المتعدد وطرق تقدير كمية TMT (45، 46)، فقد قمنا بإعادة إنتاج اتجاهات اللوحة الخاصة بنا بقوة في تحليلين متكررين (الشكل 5، C وD، والجداول S2، I، وJ). لتقييم خصوصية المرض في مجموعتنا، استخدمنا TMT-MS لتحليل مجموعة بيانات النسخ المتماثل الرابعة (CSF النسخ المتماثل 4)، والتي شملت ليس فقط التحكم (ن = 18) وحالات الإعلان (ن = 17)، ولكن أيضًا PD ( ن = 14)) وعينات ALS (ن = 18) والخرف الجبهي الصدغي (FTD) (ن = 11) (الجدول S1A). لقد نجحنا في تحديد ما يقرب من ثلثي بروتينات اللوحة في هذه المجموعة (38 من أصل 60). تسلط هذه النتائج الضوء على التغييرات الخاصة بالإعلان في جميع لوحات العلامات الحيوية الخمسة (الشكل 5E والجدول S2K). أظهرت الزيادة في مجموعة المستقلبات أقوى خصوصية لمرض الزهايمر، تليها مجموعة الميالين ومجموعة الدبقية. وبدرجة أقل، يُظهر FTD أيضًا زيادة بين هذه اللوحات، مما قد يعكس تغييرات مماثلة محتملة في الشبكة (17). في المقابل، أظهر ALS وPD نفس الملامح النخاعية والدبقية والاستقلابية تقريبًا مثل المجموعة الضابطة. بشكل عام، على الرغم من الاختلافات في إعداد العينات، ومنصة MS، وطرق القياس الكمي TMT، تظهر هذه التحليلات المتكررة أن علامات لوحة الأولوية لدينا تحتوي على تغييرات متسقة للغاية خاصة بالإعلان في أكثر من 500 عينة فريدة من نوعها من CSF.
لقد تم التعرف على التنكس العصبي AD على نطاق واسع قبل عدة سنوات من ظهور الأعراض المعرفية، لذلك هناك حاجة ملحة للمؤشرات الحيوية لـ AsymAD (5، 31). ومع ذلك، تظهر المزيد والمزيد من الأدلة أن بيولوجيا AsymAD بعيدة كل البعد عن التجانس، وأن التفاعل المعقد بين المخاطر والمرونة يؤدي إلى اختلافات فردية كبيرة في تطور المرض اللاحق (47). على الرغم من استخدامها لتحديد حالات AsymAD، إلا أن مستويات المؤشرات الحيوية الأساسية لـ CSF (Aβ1-42، مجموع تاو وp-tau) لم تثبت قدرتها على التنبؤ بشكل موثوق بمن سيتطور إلى الخرف (4، 7)، مما يشير إلى المزيد من الضروري تضمين أدوات العلامات الحيوية الشاملة بناءً على جوانب متعددة من فسيولوجيا الدماغ لتقسيم المخاطر التي تتعرض لها هذه الفئة من السكان بدقة. لذلك، قمنا لاحقًا بتحليل لوحة العلامات الحيوية التي تم التحقق من صحتها من AD في مجموعة AsymAD من نسخة CSF 1. وأظهرت حالات AsymAD الـ 31 هذه مستويات غير طبيعية من العلامات الحيوية الأساسية (Aβ1–42 / إجمالي نسبة tau ELISA، <5.5) والإدراك الكامل (يعني MoCA، 27.1) ± 2.2) (الجدول S1A). بالإضافة إلى ذلك، فإن جميع الأفراد المصابين بـ AsymAD لديهم درجة الخرف السريري تبلغ 0، مما يشير إلى عدم وجود دليل على انخفاض الأداء المعرفي أو الوظيفي اليومي.
قمنا أولاً بتحليل مستويات اللوحات التي تم التحقق من صحتها في جميع نسخ CSF الـ 96، بما في ذلك مجموعة AsymAD. لقد وجدنا أن العديد من اللوحات في مجموعة AsymAD كانت بها تغييرات كبيرة في الوفرة تشبه الإعلان، وأظهرت لوحة الأوعية الدموية اتجاهًا هبوطيًا في AsymAD، بينما أظهرت جميع اللوحات الأخرى اتجاهًا تصاعديًا (الشكل 6A). ولذلك، أظهرت جميع اللوحات وجود علاقة هامة للغاية مع ELISA Aβ1-42 ومستويات تاو الإجمالية (الشكل 6B). في المقابل، فإن العلاقة بين المجموعة ودرجة MoCA ضعيفة نسبيًا. إحدى النتائج الأكثر إثارة للانتباه من هذه التحليلات هي النطاق الكبير من وفرة اللوحات في مجموعة AsymAD. كما هو مبين في الشكل 6A، عادةً ما يعبر مستوى لوحة مجموعة AsymAD مستوى لوحة مجموعة التحكم والمجموعة AD، مما يظهر تباينًا عاليًا نسبيًا. لمزيد من استكشاف هذا التجانس في AsymAD، قمنا بتطبيق تحليل القياس متعدد الأبعاد (MDS) على 96 حالة تكرار CSF 1. يسمح تحليل MDS بتصور التشابه بين الحالات بناءً على متغيرات معينة في مجموعة البيانات. بالنسبة لهذا التحليل العنقودي، نستخدم فقط علامات اللوحة التي تم التحقق من صحتها والتي لها تغيير ذو دلالة إحصائية (P <0.05، AD/control) في اكتشاف CSF ومستوى النسخ المتماثل 1 البروتيني (n = 29) (الجدول S2L). أنتج هذا التحليل مجموعات مكانية واضحة بين سيطرتنا وحالات الإعلان (الشكل 6C). في المقابل، يتم تجميع بعض حالات AsymAD بشكل واضح في المجموعة الضابطة، بينما توجد حالات أخرى في حالات AD. لمزيد من استكشاف عدم تجانس AsymAD، استخدمنا خريطة MDS الخاصة بنا لتحديد مجموعتين من حالات AsymAD هذه. تضمنت المجموعة الأولى حالات AsymAD متجمعة بالقرب من عنصر التحكم (n = 19)، بينما تميزت المجموعة الثانية بحالات AsymAD مع ملف تعريف علامة أقرب إلى AD (n = 12).
(أ) مستوى التعبير (z-score) لمجموعة العلامات الحيوية CSF في جميع العينات الـ 96 في مجموعة النسخ المتماثل CSF 1، بما في ذلك AsymAD. تم استخدام تحليل التباين مع تصحيح توكي اللاحق لتقييم الأهمية الإحصائية للتغيرات في وفرة اللوحة. (ب) تحليل الارتباط لمستوى وفرة بروتين اللوحة (درجة z) مع درجة MoCA ومستوى تاو الإجمالي في عينات ELISA Aβ1-42 وCSF نسخة 1. يتم عرض معامل ارتباط بيرسون مع قيمة P ذات الصلة. (C) استند MDS لـ 96 حالة نسخة CSF 1 إلى مستويات الوفرة لـ 29 علامة لوحة تم التحقق من صحتها، والتي تم تغييرها بشكل كبير في كل من مجموعات بيانات الاكتشاف ونسخة CSF 1 [P <0.05 AD/control (CT)]. تم استخدام هذا التحليل لتقسيم مجموعة AsymAD إلى مجموعات فرعية تحكم (n = 19) وAD (n = 12). (د) تُظهر مؤامرة البركان التعبير التفاضلي لجميع بروتينات النسخ المتماثل CSF 1 مع تغيير أضعاف log2 (المحور السيني) بالنسبة إلى القيمة P الإحصائية -log10 بين مجموعتي AsymAD الفرعيتين. المؤشرات الحيوية للوحة ملونة. (E) يتم التعبير عن مستوى وفرة تكرار CSF 1 للمؤشرات الحيوية لمجموعة الاختيار بشكل مختلف بين مجموعات AsymAD الفرعية. تم استخدام تحليل التباين المعدل بعد توكي لتقييم الأهمية الإحصائية.
درسنا تعبير البروتين التفاضلي بين حالات التحكم هذه وحالات AsymAD المشابهة لـ AD (الشكل 6D والجدول S2L). تُظهر خريطة البركان الناتجة أن 14 علامة لوحة قد تغيرت بشكل ملحوظ بين المجموعتين. معظم هذه العلامات هي أعضاء في المشبك والأيض. ومع ذلك ، فإن SOD1 وركيزة كيناز C الغنية ببروتين الألانين (MARCKS) ، والتي هي أعضاء في مجموعات المناعة المايلينية والدبقية ، على التوالي ، تنتمي أيضًا إلى هذه المجموعة (الشكل 6 و D و E). ساهمت لوحة الأوعية الدموية أيضًا في وجود علامتين تم تخفيضهما بشكل كبير في مجموعة AsymAD الشبيهة بـ AD، بما في ذلك بروتين ربط AE 1 (AEBP1) وعضو العائلة المكمل C9. لم يكن هناك فرق كبير بين مجموعات التحكم ومجموعات AsymAD الفرعية المشابهة لـ AD في ELISA AB1-42 (P = 0.38) وp-tau (P = 0.28)، ولكن كان هناك بالفعل فرق كبير في مستوى tau الإجمالي (P = 0.0031) ) (الشكل S7). هناك العديد من علامات اللوحة التي تشير إلى أن التغييرات بين المجموعتين الفرعيتين AsymAD أكثر أهمية من إجمالي مستويات تاو (على سبيل المثال، YWHAZ، SOD1، وMDH1) (الشكل 6E). بشكل عام، تشير هذه النتائج إلى أن اللوحة التي تم التحقق من صحتها قد تحتوي على مؤشرات حيوية يمكنها التصنيف الفرعي والتقسيم الطبقي للمخاطر المحتملة للمرضى الذين يعانون من مرض بدون أعراض.
هناك حاجة ملحة لأدوات العلامات الحيوية القائمة على النظام لقياس واستهداف الفيزيولوجيا المرضية المختلفة وراء مرض الزهايمر بشكل أفضل. من المتوقع ألا تؤدي هذه الأدوات إلى تغيير إطار تشخيص مرض الزهايمر لدينا فحسب، بل ستشجع أيضًا على اعتماد استراتيجيات علاجية فعالة خاصة بالمريض (1، 2). ولتحقيق هذه الغاية، قمنا بتطبيق نهج بروتيني شامل وغير متحيز على دماغ AD وCSF لتحديد المؤشرات الحيوية لـ CSF على شبكة الإنترنت والتي تعكس مجموعة واسعة من الفيزيولوجيا المرضية القائمة على الدماغ. أنتج تحليلنا خمس لوحات للعلامات الحيوية لـ CSF، والتي (1) تعكس المشابك العصبية والأوعية الدموية والمايلين والخلل المناعي والتمثيل الغذائي؛ (2) إثبات إمكانية تكرار نتائج قوية على منصات MS مختلفة؛ (3) إظهار التغيرات التدريجية الخاصة بالمرض خلال المراحل المبكرة والمتأخرة من مرض الزهايمر. بشكل عام، تمثل هذه النتائج خطوة واعدة نحو تطوير أدوات العلامات الحيوية المتنوعة والموثوقة والموجهة نحو الويب لأبحاث مرض الزهايمر والتطبيقات السريرية.
تُظهر نتائجنا التنظيم المحفوظ للغاية لبروتين شبكة الدماغ AD وتدعم استخدامه كمرساة لتطوير العلامات الحيوية القائمة على النظام. يوضح تحليلنا أن مجموعتي بيانات TMT-MS المستقلتين اللتين تحتويان على أدمغة AD وAsymAD لهما نمطية قوية. توسع هذه النتائج عملنا السابق، مما يدل على الحفاظ على الوحدات القوية لأكثر من 2000 أنسجة دماغية من مجموعات مستقلة متعددة في القشرة الأمامية والجدارية والزمانية (17). تعكس شبكة الإجماع هذه العديد من التغييرات المرتبطة بالأمراض التي لوحظت في الأبحاث الحالية، بما في ذلك زيادة الوحدات الالتهابية الغنية بالخلايا الدبقية وانخفاض الوحدات الغنية بالخلايا العصبية. مثل الأبحاث الحالية، تتميز هذه الشبكة واسعة النطاق أيضًا بتغييرات معيارية كبيرة في AsymAD، مما يوضح مجموعة متنوعة من الفيزيولوجيا المرضية المختلفة قبل السريرية (17).
ومع ذلك، ضمن هذا الإطار المحافظ للغاية القائم على النظام، هناك عدم تجانس بيولوجي أكثر دقة، خاصة بين الأفراد في المراحل الأولى من مرض الزهايمر. لوحة العلامات الحيوية الخاصة بنا قادرة على تصوير مجموعتين فرعيتين في AsymAD، والتي توضح التعبير التفاضلي الكبير لعلامات CSF المتعددة. تمكنت مجموعتنا من تسليط الضوء على الاختلافات البيولوجية بين هاتين المجموعتين الفرعيتين، والتي لم تكن واضحة على مستوى المؤشرات الحيوية الأساسية لمرض الزهايمر. بالمقارنة مع المجموعة الضابطة، كانت نسب Aβ1-42/إجمالي تاو لأفراد AsymAD منخفضة بشكل غير طبيعي. ومع ذلك، كانت مستويات تاو الإجمالية فقط مختلفة بشكل كبير بين مجموعتي AsymAD الفرعيتين، في حين ظلت مستويات Aβ1-42 وp-tau قابلة للمقارنة نسبيًا. نظرًا لأن ارتفاع تاو CSF يبدو مؤشرًا أفضل للأعراض المعرفية مقارنة بمستويات Aβ1-42 (7)، فإننا نشك في أن مجموعتي AsymAD قد يكون لهما مخاطر مختلفة لتطور المرض. نظرًا لحجم عينة AsymAD المحدود لدينا ونقص البيانات الطولية، هناك حاجة إلى مزيد من البحث لاستخلاص هذه الاستنتاجات بثقة. ومع ذلك، تشير هذه النتائج إلى أن لوحة CSF القائمة على النظام يمكن أن تعزز قدرتنا على تقسيم الأفراد إلى طبقات بشكل فعال خلال المرحلة بدون أعراض من المرض.
وبشكل عام، تدعم النتائج التي توصلنا إليها دور الوظائف البيولوجية المتعددة في التسبب في مرض الزهايمر. ومع ذلك، أصبح استقلاب الطاقة غير المنظم هو الموضوع البارز لجميع لوحات العلامات الخمس التي تم التحقق من صحتها. تعد البروتينات الأيضية، مثل هيبوكسانثين-جوانين فسفوريبوزيل ترانسفيراز 1 (HPRT1) ونازعة هيدروجين اللاكتات A (LDHA)، من أقوى المؤشرات الحيوية المشبكية التي تم التحقق من صحتها، مما يشير إلى أن الزيادة في AD CSF هي جنس قابل للتكاثر بدرجة كبيرة. تحتوي الأوعية الدموية والألواح الدبقية لدينا أيضًا على العديد من العلامات المشاركة في استقلاب المواد المؤكسدة. تتوافق هذه النتائج مع الدور الرئيسي الذي تلعبه العمليات الأيضية في الدماغ بأكمله، ليس فقط لتلبية الطلب العالي على الطاقة من الخلايا العصبية، ولكن أيضًا لتلبية الطلب المرتفع على الطاقة للخلايا النجمية والخلايا الدبقية الأخرى (17، 48). تدعم نتائجنا أدلة متزايدة على أن التغيرات في إمكانات الأكسدة والاختزال وانقطاع مسارات الطاقة قد تكون الرابط الأساسي بين العديد من العمليات الرئيسية المشاركة في التسبب في مرض الزهايمر، بما في ذلك اضطرابات الميتوكوندريا، والالتهابات الدبقية، وتلف الأوعية الدموية (49). بالإضافة إلى ذلك، تحتوي المؤشرات الحيوية للسائل النخاعي الأيضي على عدد كبير من البروتينات الغنية تفاضليًا بين مجموعتنا الضابطة ومجموعات AsymAD الفرعية الشبيهة بـ AD، مما يشير إلى أن تعطيل مسارات الطاقة والأكسدة والاختزال هذه قد يكون أمرًا بالغ الأهمية في المرحلة قبل السريرية للمرض .
إن الاتجاهات المختلفة للوحة الدماغ والسوائل النخاعية التي لاحظناها لها أيضًا آثار بيولوجية مثيرة للاهتمام. تُظهر المشابك العصبية والأيضات الغنية بالخلايا العصبية انخفاضًا في مستوياتها في الدماغ AD وزيادة وفرة في السائل النخاعي. وبالنظر إلى أن الخلايا العصبية غنية بالميتوكوندريا المنتجة للطاقة عند نقاط الاشتباك العصبي لتوفير الطاقة لإشاراتها المتخصصة العديدة (50)، فمن المتوقع أن يكون هناك تشابه في ملامح التعبير لهاتين المجموعتين من الخلايا العصبية. يمكن أن يفسر فقدان الخلايا العصبية وقذف الخلايا التالفة اتجاهات لوحة الدماغ والسائل الدماغي الشوكي في المرض اللاحق، لكنها لا تستطيع تفسير التغييرات المبكرة التي نلاحظها (13). أحد التفسيرات المحتملة لهذه النتائج في المرض المبكر بدون أعراض هو التقليم التشابكي غير الطبيعي. تشير الأدلة الجديدة في نماذج الفئران إلى أن البلعمة المتشابكة التي تتوسطها الخلايا الدبقية الصغيرة قد يتم تنشيطها بشكل غير طبيعي في مرض الزهايمر وتؤدي إلى فقدان المشبك العصبي المبكر في الدماغ (51). قد تتراكم هذه المادة المتشابكة المهملة في السائل الدماغي الشوكي، ولهذا السبب نلاحظ الزيادة في السائل الدماغي الشوكي في لوحة الخلايا العصبية. قد يفسر التقليم التشابكي المناعي جزئيًا أيضًا الزيادة في البروتينات الدبقية التي نلاحظها في الدماغ والسائل النخاعي طوال عملية المرض. بالإضافة إلى التقليم التشابكي، قد تؤدي التشوهات العامة في المسار الخارج للخلايا أيضًا إلى تعبيرات مختلفة للدماغ والسائل الدماغي الشوكي للعلامات العصبية. أظهر عدد من الدراسات أن محتوى الإكسوسومات في التسبب في مرض الدماغ قد تغير (52). ويشارك المسار خارج الخلية أيضًا في تكاثر Aβ (53، 54). تجدر الإشارة إلى أن قمع إفراز الإكسوسومال قد يقلل من الأمراض الشبيهة بمرض الزهايمر في نماذج الفأر المعدلة وراثيا (55).
في الوقت نفسه، أظهر البروتين الموجود في اللوحة الوعائية زيادة معتدلة في دماغ AD، لكنه انخفض بشكل ملحوظ في CSF. يمكن أن يفسر الخلل في الحاجز الدموي الدماغي (BBB) ​​هذه النتائج جزئيًا. وقد أظهرت العديد من الدراسات البشرية المستقلة بعد الوفاة انهيار BBB في م (56، 57). أكدت هذه الدراسات العديد من الأنشطة غير الطبيعية المحيطة بهذه الطبقة المغلقة بإحكام من الخلايا البطانية، بما في ذلك تسرب الشعيرات الدموية في الدماغ وتراكم البروتينات المنقولة بالدم حول الأوعية الدموية (57). يمكن أن يقدم هذا تفسيرًا بسيطًا لارتفاع بروتينات الأوعية الدموية في الدماغ، لكنه لا يمكن أن يفسر بشكل كامل استنفاد هذه البروتينات نفسها في السائل النخاعي. أحد الاحتمالات هو أن الجهاز العصبي المركزي يقوم بعزل هذه الجزيئات بشكل فعال لحل مشكلة زيادة الالتهاب والإجهاد التأكسدي. يرتبط الانخفاض في بعض بروتينات CSF الأكثر خطورة في هذه اللوحة، وخاصة تلك المشاركة في تنظيم البروتين الدهني، بتثبيط المستويات الضارة من الالتهابات وعملية الحماية العصبية لأنواع الأكسجين التفاعلية. وينطبق هذا على باروكسوناز 1 (PON1)، وهو إنزيم ربط البروتين الدهني المسؤول عن تقليل مستويات الإجهاد التأكسدي في الدورة الدموية (58، 59). يعد سلائف Alpha-1-microglobulin / bikunin (AMBP) علامة أخرى منظمة بشكل كبير لمجموعة الأوعية الدموية. إنه مقدمة البيكونين الناقل للدهون، والذي يشارك أيضًا في قمع الالتهابات والحماية العصبية (60، 61).
على الرغم من العديد من الفرضيات المثيرة للاهتمام، فإن عدم القدرة على الكشف المباشر عن آليات الأمراض البيوكيميائية يعد قيدًا معروفًا لتحليل البروتينات القائم على الاكتشاف. لذلك، من الضروري إجراء المزيد من الأبحاث لتحديد الآليات الكامنة وراء لوحات العلامات الحيوية هذه بثقة. من أجل التحرك نحو تطوير التحليل السريري القائم على مرض التصلب العصبي المتعدد، يتطلب الاتجاه المستقبلي أيضًا استخدام طرق كمية مستهدفة للتحقق من العلامات الحيوية على نطاق واسع، مثل مراقبة التفاعل الانتقائي أو المتوازي (62). استخدمنا مؤخرًا مراقبة التفاعل الموازي (63) للتحقق من صحة العديد من تغييرات بروتين CSF الموصوفة هنا. يتم تحديد العديد من أهداف لوحة الأولوية بدقة كبيرة، بما في ذلك YWHAZ وALDOA وSMOC1، والتي تحدد لوحات التشابك والتمثيل الغذائي والالتهابات لدينا، على التوالي (63). قد يكون الحصول على البيانات المستقلة (DIA) والاستراتيجيات الأخرى المستندة إلى MS مفيدًا أيضًا للتحقق من الهدف. برعم وآخرون. (64) لقد ثبت مؤخرًا أن هناك تداخلًا كبيرًا بين المؤشرات الحيوية لـ AD المحددة في مجموعة بيانات اكتشاف CSF لدينا ومجموعة بيانات DIA-MS المستقلة، والتي تتكون من ما يقرب من 200 عينة CSF من ثلاث مجموعات أوروبية مختلفة. تدعم هذه الدراسات الحديثة إمكانية تحول لوحاتنا إلى كشف موثوق يعتمد على مرض التصلب العصبي المتعدد. يعد الكشف عن الأجسام المضادة التقليدية والكشف المعتمد على الأبتمر أمرًا مهمًا أيضًا لمواصلة تطوير المؤشرات الحيوية الرئيسية لمرض الزهايمر. نظرًا لانخفاض وفرة CSF، يكون من الصعب اكتشاف هذه المؤشرات الحيوية باستخدام طرق MS عالية الإنتاجية. يعد NEFL وNRGN مثالين على المؤشرات الحيوية CSF منخفضة الوفرة، والتي تم تعيينها على اللوحة في تحليلنا الشامل، ولكن لا يمكن اكتشافها بشكل موثوق باستخدام إستراتيجية MS الفردية الخاصة بنا. استراتيجيات الاستهداف القائمة على الأجسام المضادة المتعددة، مثل PEA، قد تعزز التحول السريري لهذه العلامات.
بشكل عام، توفر هذه الدراسة نهجًا بروتينيًا فريدًا لتحديد والتحقق من المؤشرات الحيوية لـ CSF AD استنادًا إلى أنظمة مختلفة. قد يكون تحسين لوحات العلامات هذه عبر مجموعات AD ومنصات MS إضافية واعدًا لتعزيز التقسيم الطبقي لمخاطر AD وعلاجها. تعد الدراسات التي تقيم المستوى الطولي لهذه اللوحات بمرور الوقت أمرًا بالغ الأهمية أيضًا لتحديد مجموعة العلامات التي تحدد بشكل أفضل خطر الإصابة بالمرض المبكر والتغيرات في شدة المرض.
باستثناء العينات الثلاثة التي تم نسخها بواسطة CSF، تم جمع جميع عينات CSF المستخدمة في هذه الدراسة تحت رعاية Emory ADRC أو المؤسسات البحثية ذات الصلة الوثيقة. تم استخدام ما مجموعه أربع مجموعات من عينات Emory CSF في دراسات البروتينات هذه. تم العثور على مجموعة CSF تحتوي على عينات من 20 عنصر تحكم صحي و20 مريضًا م. تتضمن نسخة CSF 1 عينات من 32 فردًا صحيًا و31 فردًا من أفراد AsymAD و33 فردًا م. تحتوي نسخة CSF 2 على 147 عنصر تحكم و150 عينة إعلانية. تضمنت مجموعة تكرار CSF 4 متعددة الأمراض 18 عنصر تحكم، و17 م، و19 ALS، و13 PD، و11 عينة FTD. وفقا للاتفاقية التي وافق عليها مجلس المراجعة المؤسسية لجامعة إيموري، حصل جميع المشاركين في دراسة إيموري على موافقة مستنيرة. وفقًا للمبادئ التوجيهية لأفضل الممارسات الصادرة عن المعهد الوطني للشيخوخة لمراكز مرض الزهايمر لعام 2014 (https://alz.washington.edu/BiospecimenTaskForce.html)، تم جمع السائل النخاعي وتخزينه عن طريق البزل القطني. تلقى مرضى التحكم وAsymAD وAD تقييمًا معرفيًا موحدًا في عيادة Emory لعلم الأعصاب الإدراكي أو Goizueta ADRC. تم اختبار عينات السائل النخاعي الخاصة بهم بواسطة INNO-BIA AlzBio3 Luminex لإجراء تحليل ELISA Aβ1-42 وتحليل إجمالي تاو وp-tau (65). تُستخدم قيم ELISA لدعم التصنيف التشخيصي للموضوعات بناءً على معايير قطع العلامات الحيوية المحددة لـ AD (66، 67). يتم أيضًا الحصول على البيانات الديموغرافية والتشخيصية الأساسية لتشخيصات CSF الأخرى (FTD، وALS، وPD) من Emory ADRC أو المؤسسات البحثية التابعة لها. يمكن العثور على البيانات الوصفية الموجزة لحالات Emory CSF هذه في الجدول S1A. تم نشر خصائص مجموعة تكرار CSF السويسرية 3 مسبقًا (45).
وجدت CSF العينة. من أجل زيادة عمق اكتشافنا لمجموعة بيانات CSF، تم إجراء الاستهلاك المناعي للبروتينات عالية الوفرة قبل التربسين. باختصار، تم وضع 130 ميكرولتر من السائل الدماغي الشوكي من 40 عينة فردية من السائل الدماغي الشوكي وحجم مساوٍ (130 ميكرولتر) من راتنج استنفاد البروتين عالي التحديد Top14 (Thermo Fisher Scientific، A36372) في عمود دوران (Thermo Fisher Scientific، A89868) في الغرفة احتضان درجة الحرارة). بعد الدوران لمدة 15 دقيقة، قم بالطرد المركزي للعينة عند 1000 جرام لمدة دقيقتين. تم استخدام جهاز مرشح فائق الطرد المركزي 3K (Millipore، UFC500396) لتركيز عينة النفايات السائلة عن طريق الطرد المركزي عند 14000 جم لمدة 30 دقيقة. تمييع جميع أحجام العينات إلى 75 ميكرولتر مع محلول ملحي بالفوسفات. تم تقييم تركيز البروتين بواسطة طريقة حمض البيسينكونيك (BCA) وفقًا لبروتوكول الشركة المصنعة (Thermo Fisher Scientific). تم هضم CSF المنضب مناعيًا (60 ميكرولتر) من جميع العينات الأربعين باستخدام الليزيل إندوببتيداز (LysC) والتربسين. باختصار، تم اختزال العينة وألكلتها باستخدام 1.2 ميكرولتر 0.5 م تريس-2 (- كربوكسي إيثيل) - فوسفين و3 ميكرولتر 0.8 م كلورو أسيتاميد عند 90 درجة مئوية لمدة 10 دقائق، ثم تم صوتنة في حمام مائي لمدة 15 دقيقة. تم تخفيف العينة باستخدام 193 ميكرولتر من محلول اليوريا 8 م [8 م من اليوريا و 100 ملي مولار NaHPO4 (الرقم الهيدروجيني 8.5)] إلى تركيز نهائي قدره 6 م من اليوريا. يستخدم LysC (4.5 ميكروغرام؛ واكو) للهضم طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. تم بعد ذلك تخفيف العينة إلى 1 مولار من اليوريا مع 50 ملي مولار من بيكربونات الأمونيوم (ABC) (68). أضف كمية مساوية (4.5 ميكروغرام) من التربسين (بروميجا)، ثم قم باحتضان العينة لمدة 12 ساعة. قم بتحميض محلول الببتيد المهضوم إلى تركيز نهائي من حمض الفورميك 1% (FA) وحمض ثلاثي فلورو أسيتيك 0.1% (TFA) (66)، ثم قم بتحلية الملوحة باستخدام عمود Sep-Pak C18 (المياه) 50 مجم كما هو موضح أعلاه (25) . تمت بعد ذلك التصفية التتابعية للببتيد في 1 مل من 50% أسيتونيتريل (ACN). لتوحيد قياس كمية البروتين عبر دفعات (25)، تم دمج 100 ميكرولتر من جميع عينات CSF الأربعين لإنشاء عينة مختلطة، والتي تم تقسيمها بعد ذلك إلى خمس عينات قياسية داخلية عالمية (GIS) (48). يتم تجفيف جميع العينات الفردية والمعايير المجمعة بواسطة فراغ عالي السرعة (Labconco).
يقوم CSF بنسخ العينة. سبق أن وصف دايون وزملاؤه استنزاف المناعة وهضم عينات السائل الدماغي الشوكي 3 (45، 46). لم تكن العينات المكررة المتبقية مناعية بشكل فردي. هضم هذه العينات التي لم تتم إزالتها في التربسين كما هو موضح سابقا (17). لكل تحليل متكرر، تم تجميع 120 ميكرولتر من الببتيد المُزال من كل عينة معًا وتقسيمها إلى قسامات متساوية الحجم لاستخدامها كمعيار داخلي عالمي مسمى TMT (48). يتم تجفيف جميع العينات الفردية والمعايير المجمعة بواسطة فراغ عالي السرعة (Labconco). من أجل تعزيز إشارة بروتين CSF منخفض الوفرة، من خلال الجمع بين 125 ميكرولتر من كل عينة، تم إعداد عينة "معززة" لكل تحليل متكرر [أي عينة بيولوجية تحاكي عينة البحث، ولكن الكمية المتاحة هي أكبر بكثير (37، 69)] تم دمجها في عينة CSF مختلطة (17). تمت بعد ذلك إزالة العينة المختلطة مناعيًا باستخدام 12 مل من راتنج إزالة البروتين عالي التحديد Top14 (Thermo Fisher Scientific، A36372)، وتم هضمه كما هو موضح أعلاه، وتم تضمينه في ملصقات TMT المتعددة اللاحقة.