الحياة في درجات حرارة عالية لوحظت في المختبر باستخدام جزيئات الذهب النانوية المسخنة بالليزر

شكرا لكم لزيارة Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه لديه دعم محدود لـ CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح محدث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان الدعم المستمر، سنعرض الموقع بدون أنماط وجافا سكريبت.
Thermophiles هي الكائنات الحية الدقيقة التي تزدهر في درجات حرارة عالية. يمكن أن توفر دراستها معلومات قيمة حول كيفية تكيف الحياة مع الظروف القاسية. ومع ذلك، فمن الصعب تحقيق ظروف درجات الحرارة المرتفعة باستخدام المجاهر الضوئية التقليدية. وقد تم اقتراح العديد من الحلول محلية الصنع المعتمدة على التسخين الكهربائي المقاوم المحلي، ولكن لا يوجد حل تجاري بسيط. في هذا البحث، نقدم مفهوم التسخين بالليزر المجهري فوق مجال رؤية المجهر لتوفير درجات حرارة عالية للدراسات المحبة للحرارة مع الحفاظ على بيئة المستخدم معتدلة. يمكن تحقيق التسخين المجهري بكثافة ليزر معتدلة باستخدام ركيزة مطلية بالجسيمات النانوية الذهبية كممتص للضوء فعال ومتوافق حيويًا. تمت مناقشة التأثيرات المحتملة للحمل الحراري للسوائل المجهرية، واحتباس الخلايا، وحركة الطرد المركزي الحراري. وقد تم توضيح هذه الطريقة في نوعين: (1) Geobacillus stearothermophilus، وهي بكتيريا نشطة محبة للحرارة تتكاثر عند حوالي 65 درجة مئوية، والتي لاحظنا أنها تنبت وتنمو وتسبح تحت تسخين مجهري؛ (2) Thiobacillus sp.، وهي عتيقة شديدة الحرارة على النحو الأمثل. عند 80 درجة مئوية. يمهد هذا العمل الطريق لمراقبة بسيطة وآمنة للكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة باستخدام أدوات الفحص المجهري الحديثة وبأسعار معقولة.
على مدى مليارات السنين، تطورت الحياة على الأرض لتتكيف مع مجموعة واسعة من الظروف البيئية التي تعتبر أحيانًا متطرفة من وجهة نظرنا البشرية. على وجه الخصوص، تزدهر بعض الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة (البكتيريا، والعتائق، والفطريات) التي تسمى المحبة للحرارة في نطاق درجات الحرارة من 45 درجة مئوية إلى 122 درجة مئوية. وتعيش الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة في أنظمة بيئية مختلفة، مثل الفتحات الحرارية المائية في أعماق البحار، والينابيع الساخنة. أو المناطق البركانية. وقد أثارت أبحاثهم الكثير من الاهتمام على مدى العقود القليلة الماضية لسببين على الأقل. أولًا، يمكننا أن نتعلم منها، على سبيل المثال، كيف تكون المحبة للحرارة 5، 6، والإنزيمات 7، 8، والأغشية 9 مستقرة عند درجات الحرارة المرتفعة هذه، أو كيف يمكن للمحبة للحرارة أن تتحمل المستويات القصوى من الإشعاع 10. ثانيًا، فهي الأساس للعديد من تطبيقات التكنولوجيا الحيوية المهمة1،11،12 مثل إنتاج الوقود13،14،15،16، والتخليق الكيميائي (ثنائي الهيدرو، والكحول، والميثان، والأحماض الأمينية، وما إلى ذلك)17، والتعدين الحيوي18 والمحفزات الحيوية القابلة للحرارة7،11، 13. على وجه الخصوص، يتضمن تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) 19 المعروف حاليًا إنزيمًا (بوليميراز طق) معزولًا من البكتيريا المحبة للحرارة Thermus aquaticus، وهي واحدة من أوائل الكائنات المحبة للحرارة التي تم اكتشافها.
ومع ذلك، فإن دراسة الكائنات المحبة للحرارة ليست مهمة سهلة ولا يمكن ارتجالها في أي مختبر بيولوجي. على وجه الخصوص، لا يمكن ملاحظة الكائنات الحية المحبة للحرارة في المختبر باستخدام أي مجهر ضوئي قياسي، حتى مع غرف التسخين المتاحة تجاريًا، والتي عادةً ما يتم تصنيفها لدرجات حرارة منخفضة تصل إلى 40 درجة مئوية. منذ التسعينيات، لم يخصص سوى عدد قليل من المجموعات البحثية نفسها لإدخال أنظمة الفحص المجهري عالي الحرارة (HTM). في عام 1994 جلوخ وآخرون. تم تصميم غرفة التسخين/التبريد بناءً على استخدام خلية بلتيير التي تتحكم في درجة حرارة الشعيرات الدموية المستطيلة المغلقة للحفاظ على اللاهوائية 20. يمكن تسخين الجهاز حتى 100 درجة مئوية بمعدل 2 درجة مئوية/ثانية، مما يسمح للمؤلفين بدراسة حركية البكتيريا شديدة الحرارة Thermotoga maritima21. في عام 1999 هورن وآخرون. وقد تم تطوير جهاز مشابه جدًا، ولا يزال يعتمد على استخدام الشعيرات الدموية الساخنة المناسبة للفحص المجهري التجاري لدراسة انقسام/اتصال الخلايا. وبعد فترة طويلة من الخمول النسبي، استؤنف البحث عن أدوات HTM الفعالة في عام 2012، ولا سيما فيما يتعلق بسلسلة من الأبحاث التي أعدتها مجموعة ويرث والتي استخدمت جهازًا اخترعه هورن وآخرون. منذ خمسة عشر عامًا، تمت دراسة حركة عدد كبير من العتائق، بما في ذلك الكائنات شديدة الحرارة، عند درجات حرارة تصل إلى 100 درجة مئوية باستخدام الشعيرات الدموية الساخنة . قاموا أيضًا بتعديل المجهر الأصلي لتحقيق تسخين أسرع (عدة دقائق بدلاً من 35 دقيقة للوصول إلى درجة الحرارة المحددة) وتحقيق تدرج درجة حرارة خطي يزيد عن 2 سم عبر الوسط. تم استخدام جهاز تشكيل التدرج الحراري هذا (TGFD) لدراسة حركة العديد من المحبين للحرارة داخل التدرجات الحرارية على مسافات ذات صلة بيولوجيًا 24، 25.
تسخين الشعيرات الدموية المغلقة ليس الطريقة الوحيدة لمراقبة الكائنات الحية المحبة للحرارة. في عام 2012، كوابارا وآخرون. تم استخدام غرف بيركس محلية الصنع يمكن التخلص منها ومختومة بمادة لاصقة مقاومة للحرارة (Super X2؛ Cemedine، اليابان). تم وضع العينات على لوحة تسخين شفافة متاحة تجاريًا (Micro Heat Plate، شركة Kitazato، اليابان) قادرة على التسخين حتى 110 درجة مئوية، ولكنها ليست مخصصة في الأصل للتصوير الحيوي. لاحظ المؤلفون الانقسام الفعال للبكتيريا اللاهوائية المحبة للحرارة (Thermosipho globiformans، مدة مضاعفة 24 دقيقة) عند 65 درجة مئوية. في عام 2020، بولشين وآخرون. تم إثبات التسخين الفعال للأطباق المعدنية التجارية (AttofluorTM، Thermofisher) باستخدام عنصري تسخين منزليين: غطاء ومسرح (تكوين مستوحى من آلة PCR). يؤدي هذا الارتباط إلى درجة حرارة سائلة موحدة ويمنع التبخر والتكثيف في الجزء السفلي من الغطاء. يؤدي استخدام الحلقة O إلى تجنب تبادل الغازات مع البيئة. تم استخدام هذا HTM، المسمى Sulfscope، لتصوير Sulfolobus acidocaldarius عند 75 درجة مئوية.
كان أحد القيود المعترف بها لجميع هذه الأنظمة هو القيود المفروضة على استخدام الأهداف الجوية، حيث أن أي غمر بالزيت غير مناسب لدرجة الحرارة المرتفعة هذه وللتصوير من خلال عينات شفافة يزيد سمكها عن 1 مم. كان أحد القيود المعترف بها لجميع هذه الأنظمة هو القيود المفروضة على استخدام الأهداف الجوية، حيث أن أي غمر بالزيت غير مناسب لدرجة الحرارة المرتفعة هذه وللتصوير من خلال عينات شفافة يزيد سمكها عن 1 مم. لقد تم استغلال جميع هذه الأنظمة في استخدام الأجهزة الهوائية بعد أي غمر لا تدعم عملية التثبيت في الأساس درجات حرارة عالية جدًا ولتصور عبر أقمشة شفافة طولية > 1 مم. كان أحد العيوب المعروفة في جميع هذه الأنظمة هو القيود المفروضة على استخدام الأهداف الجوية، حيث أن أي غمر بالزيت لم يكن مناسبًا لدرجة الحرارة المرتفعة هذه وللرؤية من خلال عينات شفافة يزيد سمكها عن 1 مم.لا داعي للقلق بشأن ما إذا كنت ترغب في الحصول على أفضل النتائج، ولكن لا داعي للقلق بشأن هذه المشكلة> 1 لا داعي للقلق. أحد القيود المعترف بها لجميع هذه الأنظمة هو الحد من استخدام مرآة محصورة بالهواء، حيث أن أي غمر بالزيت غير مناسب لتصوير عينات شفافة يزيد سمكها عن 1 مم في درجات الحرارة المرتفعة هذه. جميع المتطلبات الأساسية لهذا النظام تستخدم بشكل كامل كائنات الهواء، أي غمر ليست في درجة حرارة مناسبة بدرجة كبيرة لهذه الدرجة العالية من الحرارة والتصورات عبر أقمشة شفافة طولها أكبر من 1 مم. العيب المعترف به لجميع هذه الأنظمة هو الاستخدام المحدود للعدسات الهوائية، وأي غمر بالزيت غير مناسب لدرجات الحرارة المرتفعة هذه والتصور من خلال عينات شفافة يزيد سمكها عن 1 مم.وفي الآونة الأخيرة، تم رفع هذا القيد من قبل تشارلز أورزاج وآخرون. 28، الذي طور جهازًا لم يعد يوفر الحرارة حول النظام محل الاهتمام، بل داخل زجاج الغطاء نفسه، مغطى بطبقة شفافة رقيقة من المقاوم المصنوع من ITO (أكسيد الإنديوم والقصدير). يمكن تسخين الغطاء حتى 75 درجة مئوية عن طريق تمرير تيار كهربائي عبر الطبقة الشفافة. ومع ذلك، يجب على المؤلف أيضًا تسخين العدسة إلى الهدف، ولكن ليس أكثر من 65 درجة مئوية، حتى لا تتلفها.
تظهر هذه الأعمال أن تطوير المجهر الضوئي الفعال عالي الحرارة لم يتم اعتماده على نطاق واسع، وغالبًا ما يتطلب معدات محلية الصنع، وغالبًا ما يتم تحقيقه على حساب الدقة المكانية، وهو عيب خطير نظرًا لأن الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة لا يزيد حجمها عن عدد قليل ميكرومتر. يعد انخفاض حجم التسخين هو المفتاح لحل ثلاث مشكلات متأصلة في HTM: الدقة المكانية الضعيفة، والقصور الذاتي الحراري العالي عند تسخين النظام، والتسخين الضار للعناصر المحيطة (زيت الغمر، العدسة الشيئية... أو أيدي المستخدم) في درجات حرارة شديدة. ).
في هذه الورقة، نقدم HTM للمراقبة الحرارية التي لا تعتمد على التسخين المقاوم. وبدلاً من ذلك، حققنا تسخينًا موضعيًا داخل منطقة محدودة من مجال رؤية المجهر عن طريق تشعيع الليزر لركيزة ممتصة للضوء. تم تصور توزيع درجة الحرارة باستخدام الفحص المجهري الكمي (QPM). تم إثبات فعالية هذه الطريقة من خلال Geobacillus stearothermophilus، وهي بكتيريا متحركة محبة للحرارة تتكاثر عند حوالي 65 درجة مئوية ولديها وقت مضاعفة قصير (حوالي 20 دقيقة)، وSulfolobus shibatae، وهي بكتيريا محبة للحرارة الزائدة والتي تنمو بشكل مثالي عند 80 درجة مئوية (عتيقة). للتوضيح. ولوحظ معدل التكرار الطبيعي والسباحة كدالة لدرجة الحرارة. هذا الليزر HTM (LA-HTM) لا يقتصر على سمك ساترة أو طبيعة الهدف (غمر الهواء أو الزيت). وهذا يسمح باستخدام أي عدسة عالية الدقة في السوق. كما أنه لا يعاني من بطء التسخين بسبب القصور الحراري (يحقق تسخينًا فوريًا على مقياس ميلي ثانية) ويستخدم فقط المكونات المتاحة تجاريًا. تتعلق المخاوف الجديدة الوحيدة المتعلقة بالسلامة بوجود أشعة ليزر قوية (تصل عادة إلى 100 ميجاوات) داخل الجهاز وربما من خلال العينين، الأمر الذي يتطلب نظارات واقية.
مبدأ LA-HTM هو استخدام الليزر لتسخين العينة محليًا داخل مجال رؤية المجهر (الشكل 1 أ). وللقيام بذلك، يجب أن تكون العينة ممتصة للضوء. لاستخدام قوة ليزر معقولة (أقل من 100 ميجاوات)، لم نعتمد على امتصاص الضوء بواسطة الوسط السائل، ولكننا قمنا بزيادة امتصاص العينة بشكل مصطنع عن طريق طلاء الركيزة بجزيئات الذهب النانوية (الشكل 1 ج). يعد تسخين جزيئات الذهب النانوية بالضوء ذا أهمية أساسية في مجال البلازمونات الحرارية، مع التطبيقات المتوقعة في الطب الحيوي أو الكيمياء النانوية أو حصاد ضوء الشمس . على مدى السنوات القليلة الماضية، استخدمنا LA-HTM في العديد من الدراسات المتعلقة بتطبيقات البلازما الحرارية في الفيزياء والكيمياء والبيولوجيا. تكمن الصعوبة الرئيسية في هذه الطريقة في عرض ملف درجة الحرارة النهائي، حيث أن درجة الحرارة المرتفعة تقتصر على منطقة ميكروسكلية داخل العينة. لقد أظهرنا أنه يمكن تحقيق رسم خرائط درجة الحرارة باستخدام مقياس تداخل القص المستعرض رباعي الأطوال الموجية، وهو طريقة بسيطة وعالية الدقة وحساسة للغاية للفحص المجهري الطور الكمي استنادًا إلى استخدام شبكات الحيود ثنائية الأبعاد (المعروفة أيضًا باسم الشبكات المتقاطعة). 33,34,35,36. لقد تم إثبات موثوقية تقنية الفحص المجهري الحراري، المستندة إلى الفحص المجهري لواجهة الموجة المتقاطعة (CGM)، في عشرات الأوراق البحثية المنشورة على مدار العقد الماضي.
مخطط تركيب مجهر التسخين والتشكيل ودرجة الحرارة بالليزر المتوازي. ب هندسة العينة التي تتكون من غرفة AttofluorTM التي تحتوي على ساترة مطلية بجسيمات نانوية ذهبية. ج- أنظر عن كثب إلى العينة (ليس على نطاق واسع). يمثل d ملف تعريف شعاع الليزر الموحد و ( هـ ) محاكاة توزيع درجة الحرارة اللاحقة على مستوى عينة الجسيمات النانوية الذهبية. f عبارة عن ملف تعريف شعاع ليزر حلقي مناسب لتوليد درجة حرارة موحدة كما هو موضح في محاكاة توزيع درجة الحرارة الناتجة الموضحة في (ز). شريط النطاق: 30 ميكرومتر.
على وجه الخصوص، حققنا مؤخرًا تسخين خلايا الثدييات باستخدام LA-HTM وCGM وتتبعنا استجابات الصدمة الحرارية الخلوية في نطاق 37-42 درجة مئوية، مما يدل على إمكانية تطبيق هذه التقنية على تصوير خلية حية واحدة. ومع ذلك، فإن تطبيق LA-HTM على دراسة الكائنات الحية الدقيقة في درجات حرارة عالية ليس واضحًا، لأنه يتطلب المزيد من الحذر مقارنة بخلايا الثدييات: أولاً، يؤدي تسخين قاع الوسط بعشرات الدرجات (بدلاً من بضع درجات) إلى تدرج قوي في درجة الحرارة العمودية. يمكن أن يخلق انتقالًا حراريًا للسوائل 44 والذي، إذا لم يتم تثبيته بقوة على الركيزة، يمكن أن يسبب حركة غير مرغوب فيها واختلاطًا للبكتيريا. يمكن التخلص من هذا الحمل الحراري عن طريق تقليل سمك الطبقة السائلة. لهذا الغرض، في جميع التجارب الموضحة أدناه، تم وضع المعلقات البكتيرية بين ساترين بسماكة 15 ميكرون تقريبًا موضوعة داخل كوب معدني (AttofluorTM، Thermofisher، الشكل 1 ب، ج). من حيث المبدأ، يمكن تجنب الحمل الحراري إذا كان سمك السائل أصغر من حجم شعاع ليزر التسخين. ثانيًا، العمل في مثل هذه الهندسة المحدودة يمكن أن يؤدي إلى اختناق الكائنات الهوائية (انظر الشكل S2). يمكن تجنب هذه المشكلة عن طريق استخدام ركيزة منفذة للأكسجين (أو أي غاز حيوي آخر)، عن طريق ترك فقاعات هواء محاصرة داخل شفة الغطاء، أو عن طريق حفر ثقوب في شفة الساترة العلوية (انظر الشكل S1) 45. في هذه الدراسة، اخترنا الحل الأخير (الشكلان 1 ب وS1). وأخيرًا، لا يوفر التسخين بالليزر توزيعًا موحدًا لدرجة الحرارة. حتى عند نفس شدة شعاع الليزر (الشكل 1 د)، فإن توزيع درجة الحرارة ليس موحدًا، ولكنه يشبه التوزيع الغوسي بسبب الانتشار الحراري (الشكل 1 هـ). عندما يكون الهدف هو تحديد درجات حرارة دقيقة في مجال الرؤية لدراسة النظم البيولوجية، فإن الملامح غير المستوية ليست مثالية ويمكن أن تؤدي أيضًا إلى حركة الرحل الحراري للبكتيريا إذا لم تلتصق بالركيزة (انظر الشكل S3، S4)39. تحقيقًا لهذه الغاية، استخدمنا مُعدِّل الضوء المكاني (SLM) لتشكيل شعاع الليزر بالأشعة تحت الحمراء وفقًا لشكل الحلقة (الشكل 1f) في مستوى العينة لتحقيق توزيع موحد تمامًا لدرجة الحرارة داخل منطقة هندسية معينة، على الرغم من الانتشار الحراري (الشكل 1د) 39، 42، 46. ضع ساترة علوية فوق طبق معدني (الشكل 1ب) لتجنب تبخر الوسط وراقبه لبضعة أيام على الأقل. نظرًا لأن غطاء الغطاء العلوي هذا غير مغلق، يمكن إضافة وسط إضافي بسهولة في أي وقت إذا لزم الأمر.
لتوضيح كيفية عمل LA-HTM وإظهار إمكانية تطبيقه في الأبحاث المحبة للحرارة، قمنا بدراسة البكتيريا الهوائية Geobacillus stearothermophilus، التي تتمتع بدرجة حرارة نمو مثالية تبلغ حوالي 60-65 درجة مئوية. تحتوي البكتيريا أيضًا على الأسواط والقدرة على السباحة، مما يوفر مؤشرًا آخر للنشاط الخلوي الطبيعي.
تم تحضين العينات (الشكل 1 ب) مسبقًا عند 60 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة ثم وضعها في حامل عينة LA-HTM. يعد هذا الحضانة المسبقة اختياريًا، ولكنه لا يزال مفيدًا لسببين: أولاً، عند تشغيل الليزر، فإنه يتسبب في نمو الخلايا وانقسامها على الفور (انظر الفيلم M1 في المواد التكميلية). بدون حضانة مسبقة، يتأخر نمو البكتيريا عادةً بحوالي 40 دقيقة في كل مرة يتم فيها تسخين منطقة عرض جديدة على العينة. ثانيًا، عززت فترة ما قبل الحضانة لمدة ساعة واحدة التصاق البكتيريا بالغطاء، مما يمنع الخلايا من الانجراف خارج مجال الرؤية بسبب الرحلان الحراري عند تشغيل الليزر (انظر الفيلم M2 في المواد التكميلية). الرحلان الحراري هو حركة الجزيئات أو الجزيئات على طول التدرج في درجة الحرارة، عادة من الساخن إلى البارد، والبكتيريا ليست استثناء. يتم التخلص من هذا التأثير غير المرغوب فيه على منطقة معينة باستخدام SLM لتشكيل شعاع الليزر وتحقيق توزيع ثابت لدرجة الحرارة.
على الشكل. يوضح الشكل 2 توزيع درجة الحرارة المقاسة بواسطة CGM التي تم الحصول عليها عن طريق تشعيع ركيزة زجاجية مطلية بالجسيمات النانوية الذهبية باستخدام شعاع ليزر حلقي (الشكل 1f). ولوحظ توزيع درجة الحرارة المسطحة على كامل المنطقة التي يغطيها شعاع الليزر. تم ضبط هذه المنطقة على 65 درجة مئوية، وهي درجة الحرارة المثلى للنمو. خارج هذه المنطقة، ينخفض ​​منحنى درجة الحرارة بشكل طبيعي إلى \(1/r\) (حيث \(r\) هو الإحداثي الشعاعي).
خريطة درجة الحرارة لقياسات CGM التي تم الحصول عليها باستخدام شعاع الليزر الحلقي لإشعاع طبقة من جزيئات الذهب النانوية للحصول على ملف تعريف درجة حرارة مسطحة على منطقة دائرية. ب متساوي الحرارة لخريطة درجة الحرارة (أ). يتم تمثيل محيط شعاع الليزر بدائرة رمادية منقطة. تم تكرار التجربة مرتين (انظر المواد التكميلية، الشكل S4).
تمت مراقبة جدوى الخلايا البكتيرية لعدة ساعات باستخدام LA-HTM. على الشكل. يُظهر الشكل 3 الفاصل الزمني لأربع صور مأخوذة من فيلم مدته 3 ساعات و20 دقيقة (فيلم M3، معلومات تكميلية). وقد لوحظ أن البكتيريا تتكاثر بشكل نشط داخل المنطقة الدائرية المحددة بواسطة الليزر حيث كانت درجة الحرارة مثالية، وتقترب من 65 درجة مئوية. في المقابل، انخفض نمو الخلايا بشكل ملحوظ عندما انخفضت درجة الحرارة إلى أقل من 50 درجة مئوية لمدة 10 ثوان.
صور العمق البصري لبكتيريا G. stearothermophilus التي تنمو بعد التسخين بالليزر في أوقات مختلفة، (أ) t = 0 دقيقة، (ب) 1 ساعة و 10 دقائق، (ج) 2 ساعة و 20 دقيقة، (د) 3 ساعات و 20 دقيقة، من 200 مستخرج من فيلم مدته دقيقة واحدة (فيلم M3 متوفر في المعلومات التكميلية) متراكب على خريطة درجة الحرارة المقابلة. يتم تشغيل الليزر في الوقت \(t=0\). تمت إضافة متساوي الحرارة إلى صورة الكثافة.
لمزيد من قياس نمو الخلايا واعتمادها على درجة الحرارة، قمنا بقياس الزيادة في الكتلة الحيوية لمختلف مستعمرات البكتيريا المعزولة في البداية في مجال رؤية الفيلم M3 (الشكل 4). تظهر البكتيريا الأم المختارة في بداية تكوين وحدة تشكيل مستعمرة صغيرة (mCFU) في الشكل S6. تم إجراء قياسات الكتلة الجافة باستخدام كاميرا CGM 48 التي تم استخدامها لرسم خريطة لتوزيع درجة الحرارة. إن قدرة CGM على قياس الوزن الجاف ودرجة الحرارة هي قوة LA-HTM. كما هو متوقع، تسببت درجة الحرارة المرتفعة في نمو البكتيريا بشكل أسرع (الشكل 4 أ). كما هو مبين في المخطط شبه اللوغاريتمي في الشكل 4 ب، يتبع النمو في جميع درجات الحرارة النمو الأسي، حيث تستخدم البيانات الدالة الأسية \(m={m}_{0}{10}^{t/\ tau }+ {{ \mbox{cst}}}\)، حيث \(\tau {{{{{\rm{log }}}}}}}2\) - وقت التوليد (أو وقت المضاعفة)، \( g =1/ \tau\) - معدل النمو (عدد الأقسام لكل وحدة زمنية). على الشكل. يوضح الشكل 4 ج معدل النمو ووقت التوليد كدالة لدرجة الحرارة. تتميز mCFUs سريعة النمو بتشبع النمو بعد ساعتين، وهو سلوك متوقع بسبب الكثافة البكتيرية العالية (على غرار المرحلة الثابتة في الثقافات السائلة الكلاسيكية). يتوافق الشكل العام \(g\left(T\right)\) (الشكل 4 ج) مع المنحنى المتوقع ثنائي الطور لـ G. stearothermophilus مع معدل نمو مثالي يبلغ حوالي 60-65 درجة مئوية. قم بمطابقة البيانات باستخدام النموذج الأساسي (الشكل S5)49 حيث \(\left({{G}_{0}{;\;T}}_{{\min }};{T}_{{opt} } ؛ {T} _ {{\max}}\right)\) = (0.70 ± 0.2؛ 40 ± 4؛ 65 ± 1.6؛ 67 ± 3) درجة مئوية، وهو ما يتفق جيدًا مع القيم الأخرى المذكورة في الأدبيات . على الرغم من أن المعلمات المعتمدة على درجة الحرارة قابلة للتكرار، فإن الحد الأقصى لمعدل النمو \({G}_{0}\) قد يختلف من تجربة إلى أخرى (انظر الأشكال S7-S9 والفيلم M4). وعلى النقيض من معلمات تركيب درجة الحرارة، التي ينبغي أن تكون عالمية، فإن الحد الأقصى لمعدل النمو يعتمد على خصائص الوسط (توافر العناصر الغذائية، وتركيز الأكسجين) داخل الهندسة المجهرية المرصودة.
أ نمو الميكروبات في درجات حرارة مختلفة. mCFU: وحدات تشكيل مستعمرة مصغرة. تم الحصول على البيانات من مقطع فيديو لبكتيريا واحدة تنمو في درجة حرارة متدرجة (فيلم M3). ب مثل (أ)، مقياس شبه لوغاريتمي. ج معدل النمو \ (\ تاو \) ووقت الجيل \ (ز \) محسوب من الانحدار الخطي ( ب ). أشرطة الخطأ الأفقية: نطاق درجة الحرارة الذي توسعت خلاله وحدات mCFU في مجال الرؤية أثناء النمو. أشرطة الخطأ العمودية: الخطأ القياسي للانحدار الخطي.
بالإضافة إلى النمو الطبيعي، تطفو بعض البكتيريا أحيانًا أثناء التسخين بالليزر، وهو سلوك متوقع بالنسبة للبكتيريا ذات الأسواط. يُظهر الفيلم M5 في معلومات إضافية أنشطة السباحة هذه. في هذه التجربة، تم استخدام إشعاع الليزر الموحد لإنشاء تدرج في درجة الحرارة، كما هو مبين في الأشكال 1D وE وS3. يوضح الشكل 5 تسلسلين من الصور تم اختيارهما من فيلم M5 يوضحان أن إحدى البكتيريا تظهر حركة اتجاهية بينما تظل جميع البكتيريا الأخرى بلا حراك.
يُظهر الإطاران الزمنيان (أ) و(ب) سباحة نوعين من البكتيريا المختلفة المميزة بدوائر منقطة. تم استخراج الصور من فيلم M5 (تقدم كمواد تكميلية).
في حالة G. stearothermophilus، بدأت الحركة النشطة للبكتيريا (الشكل 5) بعد ثوانٍ قليلة من تشغيل شعاع الليزر. تؤكد هذه الملاحظة على الاستجابة الزمنية لهذه الكائنات الحية الدقيقة المحبة للحرارة لزيادة درجة الحرارة، كما لاحظ مورا وآخرون. 24 . يمكن استكشاف موضوع الحركة البكتيرية وحتى الانجذاب الحراري بشكل أكبر باستخدام LA-HTM.
لا ينبغي الخلط بين السباحة الميكروبية والأنواع الأخرى من الحركة الجسدية، وهي (1) الحركة البراونية، التي تبدو وكأنها حركة فوضوية بدون اتجاه محدد، (2) الحمل الحراري 50 والرحلان الحراري 43، الذي يتكون من انجراف منتظم للحركة على طول درجة الحرارة التدرج.
يُعرف G. stearothermophilus بقدرته على إنتاج جراثيم شديدة المقاومة (تكوين الجراثيم) عند تعرضه لظروف بيئية معاكسة كوسيلة دفاع. وعندما تصبح الظروف البيئية مواتية مرة أخرى، تنبت الجراثيم وتشكل خلايا حية وتستأنف النمو. على الرغم من أن عملية التبويض/الإنبات هذه معروفة جيدًا، إلا أنه لم يتم ملاحظتها مطلقًا في الوقت الفعلي. باستخدام LA-HTM، نورد هنا الملاحظة الأولى لأحداث الإنبات في G. stearothermophilus.
على الشكل. يُظهر الشكل 6 أ صورًا متتابعة للعمق البصري (OT) تم الحصول عليها باستخدام مجموعة CGM المكونة من 13 جراثيم. طوال فترة التجميع بأكملها (15 ساعة و6 دقائق، \(t=0\) - بداية التسخين بالليزر)، إنبتت 4 جراثيم من أصل 13، في نقاط زمنية متتالية \(t=2\) h، \( 3\ ) h \(10 \)'، \(9\) ح \(40\)' و \(11\) ح \(30\)'. على الرغم من أن واحدًا فقط من هذه الأحداث يظهر في الشكل 6، إلا أنه يمكن ملاحظة 4 أحداث إنبات في فيلم M6 في المادة التكميلية. ومن المثير للاهتمام أن الإنبات يبدو عشوائيًا: فليست كل الجراثيم تنبت ولا تنبت في نفس الوقت، على الرغم من نفس التغيرات في الظروف البيئية.
الفاصل الزمني الذي يتكون من 8 صور OT (غمر الزيت، 60x، 1.25 هدف NA) و (ب) تطور الكتلة الحيوية لمجاميع G. stearothermophilus. ج ( ب ) مرسوم على مقياس شبه سجل لتسليط الضوء على الخطية لمعدل النمو (خط متقطع).
على الشكل. يُظهر الشكل 6 ب، ج الكتلة الحيوية لمجموعات الخلايا في مجال الرؤية كدالة للوقت خلال فترة جمع البيانات بأكملها. لوحظ التحلل السريع للكتلة الجافة عند \(t=5\)h في الشكل. 6 ب، ج، بسبب خروج بعض الخلايا من مجال الرؤية. معدل نمو هذه الأحداث الأربعة هو \(0.77\pm 0.1\) h-1. وهذه القيمة أعلى من معدل النمو المرتبط بالشكل 3. 3 و4، حيث تنمو الخلايا بشكل طبيعي. سبب زيادة معدل نمو G. stearothermophilus من الجراثيم غير واضح، ولكن هذه القياسات تسلط الضوء على اهتمام LA-HTM والعمل على مستوى الخلية المفردة (أو على مستوى mCFU المفرد) لمعرفة المزيد عن ديناميكيات حياة الخلية .
ولتوضيح مدى تعدد استخدامات LA-HTM وأدائه في درجات الحرارة المرتفعة، قمنا بفحص نمو Sulfolobus shibatae، وهي عتائق محبة للحمض شديدة الحرارة مع درجة حرارة نمو مثالية تبلغ 80 درجة مئوية. بالمقارنة مع G. stearothermophilus، فإن هذه العتائق لها أيضًا شكل مختلف تمامًا، تشبه كرات 1 ميكرون (مكورات) بدلاً من العصيات الطويلة (العصيات).
يتكون الشكل 7 أ من صور العمق البصري المتسلسلة لـ S. shibatae mCFU التي تم الحصول عليها باستخدام CGM (انظر الفيلم المميز M7 في المواد التكميلية). ينمو هذا mCFU عند حوالي 73 درجة مئوية، أي أقل من درجة الحرارة المثلى البالغة 80 درجة مئوية، ولكن ضمن نطاق درجة الحرارة للنمو النشط. لقد لاحظنا العديد من أحداث الانشطار التي جعلت وحدات mCFU تبدو وكأنها عناقيد دقيقة من العتائق بعد بضع ساعات. من هذه الصور OT، تم قياس الكتلة الحيوية mCFU مع مرور الوقت وعرضها في الشكل 7ب. ومن المثير للاهتمام أن S. shibatae mCFUs أظهر نموًا خطيًا بدلاً من النمو الأسي الذي شوهد مع G. stearothermophilus mCFUs. لقد كان هناك نقاش طويل الأمد 52 حول طبيعة معدلات نمو الخلايا: فبينما تشير بعض الدراسات إلى معدلات نمو للميكروبات تتناسب مع حجمها (النمو الأسي)، تظهر دراسات أخرى معدلًا ثابتًا (نمو خطي أو ثنائي الخط). وكما أوضح تسور وآخرون.53، فإن التمييز بين النمو الأسي والنمو الخطي (ثنائي) يتطلب دقة أقل من 6% في قياسات الكتلة الحيوية، وهو أمر بعيد المنال بالنسبة لمعظم تقنيات QPM، حتى التي تنطوي على قياس التداخل. وكما أوضح تسور وآخرون.53، فإن التمييز بين النمو الأسي والنمو الخطي (ثنائي) يتطلب دقة أقل من 6% في قياسات الكتلة الحيوية، وهو أمر بعيد المنال بالنسبة لمعظم تقنيات QPM، حتى التي تنطوي على قياس التداخل. كما تم تكليفه بـ ثور و د.53، فإن الاختلاف الاستثنائي و (ب) الخطي يحتاج إلى نسبة <6٪ في الكتلة الحيوية المتنوعة، وهو أمر غير ضروري لدينا المزيد من أساليب QPM، حتى مع استخدام قياسات التداخل. وكما أوضح زور وآخرون.53، يتطلب التمييز بين النمو الأسي والنمو الخطي (ثنائي) دقة أقل من 6% في قياسات الكتلة الحيوية، وهو أمر بعيد المنال بالنسبة لمعظم طرق QPM، حتى باستخدام قياس التداخل.كما أوضح زور وآخرون. 53، يتطلب التمييز بين النمو الأسي والنمو الخطي (ثنائي) دقة أقل من 6٪ في قياسات الكتلة الحيوية، وهو أمر بعيد المنال بالنسبة لمعظم طرق QPM، حتى عند استخدام قياس التداخل. تحقق CGM هذه الدقة بدقة فرعية في قياسات الكتلة الحيوية .
الفاصل الزمني الذي يتكون من 6 صور OT (غمر الزيت، 60x، هدف NA 1.25) و (ب) تطور الكتلة الحيوية الصغيرة CFU المقاسة باستخدام CGM. شاهد الفيلم M7 لمزيد من المعلومات.
كان النمو الخطي تمامًا لـ S. shibatae غير متوقع ولم يتم الإبلاغ عنه بعد. ومع ذلك، من المتوقع حدوث نمو أسي، على الأقل لأنه مع مرور الوقت، يجب أن تحدث انقسامات متعددة لـ 2، 4، 8، 16... خلية. لقد افترضنا أن النمو الخطي قد يكون بسبب تثبيط الخلايا بسبب تعبئة الخلايا الكثيفة، تمامًا كما يتباطأ نمو الخلايا ويصل في النهاية إلى حالة نائمة عندما تكون كثافة الخلية مرتفعة جدًا.
نختتم بمناقشة نقاط الاهتمام الخمس التالية بدورها: تقليل حجم التسخين، وتقليل القصور الذاتي الحراري، والاهتمام بجزيئات الذهب النانوية، والاهتمام بمجهر الطور الكمي، ونطاق درجة الحرارة المحتمل الذي يمكن استخدام LA-HTM فيه.
بالمقارنة مع التسخين المقاوم، فإن التسخين بالليزر المستخدم لتطوير HTM يوفر العديد من المزايا، والتي نوضحها في هذه الدراسة. على وجه الخصوص، في الوسائط السائلة في مجال رؤية المجهر، يتم الاحتفاظ بحجم التسخين ضمن عدد قليل (10 ميكرومتر) 3 مجلدات. بهذه الطريقة، تكون الميكروبات المرصودة فقط هي النشطة، بينما تكون البكتيريا الأخرى خاملة ويمكن استخدامها لإجراء مزيد من الدراسة للعينة - ليست هناك حاجة لتغيير العينة في كل مرة يلزم فيها فحص درجة حرارة جديدة. بالإضافة إلى ذلك، يسمح التسخين المجهري بالفحص المباشر لمجموعة كبيرة من درجات الحرارة: تم الحصول على الشكل 4ج من فيلم مدته 3 ساعات (فيلم M3)، والذي يتطلب عادةً إعداد وفحص عدة عينات - واحدة لكل عينة من العينات قيد الدراسة. y هي درجة الحرارة التي تمثل عدد أيام التجربة. يؤدي تقليل الحجم الساخن أيضًا إلى إبقاء جميع المكونات البصرية المحيطة بالمجهر، وخاصة العدسة الشيئية، في درجة حرارة الغرفة، وهو ما يمثل مشكلة كبيرة يواجهها المجتمع حتى الآن. يمكن استخدام LA-HTM مع أي عدسة، بما في ذلك العدسات المغمورة بالزيت، وستبقى في درجة حرارة الغرفة حتى مع درجات الحرارة القصوى في مجال الرؤية. القيد الرئيسي لطريقة التسخين بالليزر التي أبلغنا عنها في هذه الدراسة هو أن الخلايا التي لا تلتصق أو تطفو قد تكون بعيدة عن مجال الرؤية ويصعب دراستها. يمكن أن يكون الحل البديل هو استخدام عدسات منخفضة التكبير لتحقيق ارتفاع أكبر في درجة الحرارة بما يزيد عن بضع مئات من الميكرونات. ويصاحب هذا الحذر انخفاض في الدقة المكانية، ولكن إذا كان الهدف هو دراسة حركة الكائنات الحية الدقيقة، فلا يلزم وجود دقة مكانية عالية.
يعتمد المقياس الزمني لتسخين (وتبريد) النظام \({{{{\rm{\tau }}}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}\) على حجمه، وفقًا للقانون \({{{({\rm{\tau }}}}}}}_{{{\mbox{D}}}}={L}^{2}/D\)، حيث \ (L\ ) هو الحجم المميز لمصدر الحرارة (قطر شعاع الليزر في دراستنا هو \(L\ حوالي 100\) ميكرومتر)، \(D\) هو الانتشار الحراري للبيئة (المتوسط ​​في دراستنا الحالة والزجاج والماء معدل الانتشار \(D\ حوالي 2\fold {10}^{-7}\) م2/ث)، لذلك في هذه الدراسة، استجابات زمنية في حدود 50 مللي ثانية، أي شبه لحظية. يمكن توقع التغيرات في درجات الحرارة، وهذا الإنشاء الفوري لارتفاع درجة الحرارة لا يؤدي إلى تقصير مدة التجربة فحسب، بل يسمح أيضًا بالتوقيت الدقيق \(t=0\) لأي دراسة ديناميكية لتأثيرات درجة الحرارة.
تنطبق طريقتنا المقترحة على أي ركيزة ممتصة للضوء (على سبيل المثال، العينات التجارية مع طلاء ITO). ومع ذلك، فإن جسيمات الذهب النانوية قادرة على توفير امتصاص عالي في الأشعة تحت الحمراء وامتصاص منخفض في النطاق المرئي، والخصائص الأخيرة لها أهمية للمراقبة البصرية الفعالة في النطاق المرئي، خاصة عند استخدام الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك، الذهب متوافق حيويا، خامل كيميائيا، ويمكن تعديل الكثافة البصرية من 530 نانومتر إلى الأشعة تحت الحمراء القريبة، وإعداد العينة بسيط واقتصادي.
لا يسمح الفحص المجهري لواجهة الموجة المستعرضة (CGM) برسم خرائط لدرجة الحرارة على المستوى المجهري فحسب، بل يسمح أيضًا بمراقبة الكتلة الحيوية، مما يجعله مفيدًا بشكل خاص (إن لم يكن ضروريًا) بالاشتراك مع LA-HTM. على مدى العقد الماضي، تم تطوير تقنيات الفحص المجهري لدرجة الحرارة الأخرى، وخاصة في مجال التصوير الحيوي، ومعظمها يتطلب استخدام مجسات الفلورسنت الحساسة لدرجة الحرارة. ومع ذلك، فقد تم انتقاد هذه الأساليب وقامت بعض التقارير بقياس تغيرات غير واقعية في درجات الحرارة داخل الخلايا، ربما يرجع ذلك إلى حقيقة أن التألق يعتمد على عوامل كثيرة غير درجة الحرارة. وبالإضافة إلى ذلك، فإن معظم مجسات الفلورسنت تكون غير مستقرة عند درجات الحرارة المرتفعة. لذلك، QPM وعلى وجه الخصوص CGM تمثل تقنية الفحص المجهري لدرجة الحرارة المثالية لدراسة الحياة في درجات حرارة عالية باستخدام المجهر الضوئي.
تظهر الدراسات التي أجريت على S. shibatae، التي تعيش بشكل مثالي عند 80 درجة مئوية، أنه يمكن تطبيق LA-HTM لدراسة محبي الحرارة المرتفعة، وليس فقط محبي الحرارة البسيطة. من حيث المبدأ، لا يوجد حد لنطاق درجات الحرارة التي يمكن الوصول إليها باستخدام LA-HTM، وحتى درجات الحرارة التي تزيد عن 100 درجة مئوية يمكن الوصول إليها عند الضغط الجوي دون غليان، كما يتضح من مجموعتنا المكونة من 38 فردًا في تطبيقات الكيمياء الحرارية المائية في الغلاف الجوي. الضغط أ. يستخدم الليزر لتسخين جزيئات الذهب النانوية 40 بنفس الطريقة. وبالتالي، فإن LA-HTM لديها القدرة على استخدامها لمراقبة ارتفاع الحرارة غير المسبوق باستخدام المجهر الضوئي القياسي عالي الدقة في ظل الظروف القياسية (أي تحت الضغط البيئي).
تم إجراء جميع التجارب باستخدام مجهر محلي الصنع، بما في ذلك إضاءة Köhler (مع LED، M625L3، Thorlabs، 700 ميجاوات)، حامل العينة بحركة xy اليدوية، الأهداف (Olympus، 60x، 0.7 NA، air، LUCPlanFLN60X أو 60x، 1.25 NA، Oil ، UPLFLN60XOI)، كاميرا CGM (شبكة QLSI المتقاطعة، مسافة 39 ميكرومتر، 0.87 مم من مستشعر الكاميرا Andor Zyla) لتوفير تصوير الكثافة وواجهة الموجة، وكاميرا sCMOS (ORCA Flash 4.0 V3، وضع 16 بت، من هاماماتسو) لتسجيل البيانات المبينة في الشكل 5 (السباحة البكتيرية). إن جهاز تقسيم الشعاع مزدوج اللون هو حافة BrightLine بطول 749 نانومتر (Semrock، FF749-SDi01). الفلتر الموجود في الجزء الأمامي من الكاميرا هو مرشح تمرير قصير 694 (FF02-694/SP-25، Semrock). ليزر ياقوت التيتانيوم (ليزر Verdi G10، 532 نانومتر، 10 وات، تجويف ليزر تسونامي مضخوخ، Spectra-Physics في الشكل 2-5، تم استبداله أيضًا بليزر Millenia، Spectraphysics 10 W، تجويف ليزر Mira المضخوخ، Coherent، للشكل 2). -5). تم ضبط الشكلين 6 و 7) على الطول الموجي \({{{({\rm{\lambda }}}}}=800\) نانومتر، والذي يتوافق مع طيف رنين البلازمون للجسيمات النانوية الذهبية. مُعدِّلات الضوء المكانية (1920 × تم شراء 1152 بكسل) من Meadowlark Optics. تم حساب الصور المجسمة باستخدام خوارزمية Gerchberg-Saxton كما هو موضح في الرابط 39.
الفحص المجهري لواجهة الموجة المتقاطعة (CGM) هو تقنية مجهرية بصرية تعتمد على الجمع بين محزوز الحيود ثنائي الأبعاد (المعروف أيضًا باسم المشبك المتقاطع) على مسافة ملليمتر واحد من مستشعر الكاميرا التقليدية. يُطلق على المثال الأكثر شيوعًا لجهاز مراقبة الغلوكوز المستمر (CGM) الذي استخدمناه في هذه الدراسة اسم مقياس تداخل التحول العرضي ذي الطول الموجي (QLSI)، حيث يتكون الشبكة المتقاطعة من نمط رقعة الشطرنج للكثافة/الطور الذي تم تقديمه وحصل على براءة اختراع بواسطة Primot et al. في 200034. تخلق الخطوط الشبكية الرأسية والأفقية ظلالًا تشبه الشبكة على المستشعر، ويمكن معالجة تشويهها رقميًا في الوقت الفعلي للحصول على تشويه واجهة الموجة البصرية (أو ملف تعريف الطور المكافئ) للضوء الساقط. عند استخدامها على المجهر، يمكن لكاميرا CGM عرض اختلاف المسار البصري لجسم مصور، المعروف أيضًا باسم العمق البصري (OT)، مع حساسية في حدود نانومتر. في أي قياس CGM، من أجل القضاء على أي عيوب في المكونات البصرية أو الحزم، يجب التقاط صورة OT مرجعية أساسية وطرحها من أي صور لاحقة.
تم إجراء الفحص المجهري لدرجة الحرارة باستخدام كاميرا CGM كما هو موضح في المرجع. 32. باختصار، تسخين السائل يغير معامل انكساره، مما يخلق تأثير العدسة الحرارية الذي يشوه الشعاع الساقط. يتم قياس تشويه واجهة الموجة هذا بواسطة CGM ويتم معالجته باستخدام خوارزمية deconvolution للحصول على توزيع ثلاثي الأبعاد لدرجة الحرارة في الوسط السائل. إذا تم توزيع جزيئات الذهب النانوية بالتساوي في جميع أنحاء العينة، فيمكن إجراء رسم خرائط لدرجة الحرارة في مناطق خالية من البكتيريا لإنتاج صور أفضل، وهو ما نفعله أحيانًا. تم الحصول على صورة CGM المرجعية بدون تسخين (مع إيقاف تشغيل الليزر) وتم التقاطها لاحقًا في نفس الموقع في الصورة مع تشغيل الليزر.
يتم قياس الكتلة الجافة باستخدام نفس كاميرا CGM المستخدمة لتصوير درجة الحرارة. تم الحصول على الصور المرجعية لـ CGM عن طريق تحريك العينة بسرعة في x و y أثناء التعرض كوسيلة لحساب متوسط ​​أي عدم تجانس في OT بسبب وجود البكتيريا. من صور OT للبكتيريا، تم الحصول على كتلتها الحيوية باستخدام مجموعة من الصور في المناطق المحددة باستخدام خوارزمية التجزئة محلية الصنع الخاصة بـ Matlab (انظر القسم الفرعي "الرمز الرقمي")، باتباع الإجراء الموضح في المرجع. 48. باختصار، نستخدم العلاقة \(m={\alpha}^{-1}\iint {{\mbox{OT}}}\left(x,y\right){{\mbox{d}} } x{{\mbox{d}}}y\)، حيث \({{\mbox{OT}}}\left(x,y\right)\) هي صورة العمق البصري، \(m\) هي الوزن الجاف و \({{{{\rm{\alpha }}}}}}\) ثابت. لقد اخترنا \({{{{\rm{\alpha))))=0.18\) μm3/pg، وهو ثابت نموذجي للخلايا الحية.
تم وضع غطاء بقطر 25 مم وسمك 150 ميكرومتر مطلي بجسيمات نانوية ذهبية في غرفة AttofluorTM (Thermofisher) مع توجيه جسيمات الذهب النانوية للأعلى. تمت زراعة Geobacillus stearothermophilus طوال الليل في وسط LB (200 دورة في الدقيقة، 60 درجة مئوية) قبل كل يوم من التجارب. تم وضع قطرة قدرها 5 ميكرولتر من معلق G. stearothermophilus بكثافة بصرية تتراوح من 0.3 إلى 0.5 على غطاء انزلاقي يحتوي على جسيمات نانوية ذهبية. بعد ذلك، تم إسقاط غطاء دائري قطره 18 مم مع فتحة قطرها 5 مم في المنتصف على القطرة، وتم تطبيق 5 ميكرولتر من المعلق البكتيري بنفس الكثافة البصرية بشكل متكرر على مركز الحفرة. تم إعداد الآبار الموجودة على ساترة وفقا للإجراء الموضح في المرجع. 45 (انظر المعلومات التكميلية لمزيد من المعلومات). ثم أضف 1 مل من LB المتوسطة إلى ساترة لمنع الطبقة السائلة من الجفاف. يتم وضع ساترة الأخيرة على الغطاء المغلق لغرفة Attofluor™ لمنع تبخر الوسط أثناء الحضانة. بالنسبة لتجارب الإنبات، استخدمنا الجراثيم، والتي، بعد التجارب التقليدية، غطت أحيانًا الغطاء العلوي. تم استخدام طريقة مماثلة للحصول على Sulfolobus shibatae. تم إجراء ثلاثة أيام (200 دورة في الدقيقة، 75 درجة مئوية) للزراعة الأولية لـ Thiobacillus serrata في وسط 182 (DSMZ).
تم تحضير عينات من جسيمات الذهب النانوية بواسطة الطباعة الحجرية لكتلة ميسيلار كوبوليمر. تم وصف هذه العملية بالتفصيل في الفصل. 60. باختصار، تم تصنيع المذيلات المغلفة لأيونات الذهب عن طريق خلط البوليمر المشترك مع HAuCl4 في التولوين. تم بعد ذلك غمر الأغطية المنظفة في المحلول ومعالجتها بالأشعة فوق البنفسجية في وجود عامل اختزال للحصول على بذور الذهب. أخيرًا، تمت زراعة بذور الذهب عن طريق ملامسة غطاء الغطاء بمحلول مائي من KAuCl4 والإيثانولامين لمدة 16 دقيقة، مما أدى إلى ترتيب شبه دوري وموحد جدًا لجسيمات الذهب النانوية غير الكروية في الأشعة تحت الحمراء القريبة.
لتحويل مخططات التداخل إلى صور OT، استخدمنا خوارزمية محلية الصنع، كما هو مفصل في الرابط. 33 وهو متاح كحزمة Matlab في المستودع العام التالي: https://github.com/baffou/CGMprocess. يمكن للحزمة حساب الكثافة وصور OT بناءً على مخططات التداخل المسجلة (بما في ذلك الصور المرجعية) ومسافات مجموعة الكاميرا.
لحساب نمط الطور المطبق على SLM للحصول على ملف تعريف معين لدرجة الحرارة، استخدمنا خوارزمية محلية الصنع تم تطويرها مسبقًا والمتوفرة في المستودع العام التالي: https://github.com/baffou/SLM_temperatureShaping. الإدخال هو مجال درجة الحرارة المطلوبة، والذي يمكن ضبطه رقميًا أو عبر صورة bmp أحادية اللون.
لتقسيم الخلايا وقياس وزنها الجاف، استخدمنا خوارزمية Matlab المنشورة في المستودع العام التالي: https://github.com/baffou/CGM_magicWandSegmentation. في كل صورة، يجب على المستخدم النقر على البكتيريا أو mCFU محل الاهتمام، وضبط حساسية العصا، وتأكيد التحديد.
لمزيد من المعلومات حول تصميم الدراسة، راجع ملخص تقرير أبحاث الطبيعة المرتبط بهذه المقالة.
البيانات الداعمة لنتائج هذه الدراسة متاحة من المؤلفين المعنيين بناءً على طلب معقول.
تم تفصيل كود المصدر المستخدم في هذه الدراسة في قسم الأساليب، ويمكن تنزيل إصدارات تصحيح الأخطاء من https://github.com/baffou/ في المستودعات التالية: SLM_temperatureShaping، وCGMprocess، وCGM_magicWandSegmentation.
Mehta، R.، Singhal، P.، Singh، H.، Damle، D. & Sharma، AK نظرة ثاقبة على محبات الحرارة وتطبيقاتها واسعة النطاق. Mehta، R.، Singhal، P.، Singh، H.، Damle، D. & Sharma، AK نظرة ثاقبة على محبات الحرارة وتطبيقاتها واسعة النطاق.Mehta، R.، Singhal، P.، Singh، H.، Damle، D. and Sharma، AK نظرة عامة على محبات الحرارة وتطبيقاتها الواسعة. Mehta، R.، Singhal، P.، Singh، H.، Damle، D. & Sharma، AK 深入了解嗜热菌及其广谱应用. ميهتا، R.، سينغال، P.، سينغ، H.، داملي، D. وشارما، AK.Mehta R.، Singhal P.، Singh H.، Damle D. and Sharma AK فهم عميق لعشاق الحرارة ومجموعة واسعة من التطبيقات.3 التكنولوجيا الحيوية 6، 81 (2016).